茄科蔬菜立枯丝核菌的遗传分化及分子检测

论文摘要

2005-2006年,从山东泰安、寿光及陕西周至、太白等地采集辣椒和番茄立枯病、茎腐病和根腐病病株及病株周围土壤标本65份,分离、纯化得到39个立枯丝核菌菌株。菌丝融合群鉴定和5.8S rDNA-ITS区序列分析结果表明:36个菌株（占菌株总数的92.3%）属于立枯丝核菌的AG-4融合群,仅有3个菌株属于AG-5融合群（占分离菌株总数的7.7%）;隶属AG-4融合群的菌株又进一步分为AG-4-HG-I和AG-4-HG-III融合亚群,隶属此两个亚群的供试菌株与此两个亚群的标准菌株相比,其5.8S rDNA-ITS区序列一致性达99%-100%。本研究还进一步证明AG-4-HG-I群的菌株为茄科蔬菜根部病害的优势致病群,占分离菌株总数的79.5%;AG-4-HG-III群菌株占分离菌株总数的12.8%,居分离菌株总数的第二位。此亚群为国内首次在茄科蔬菜上分离得到。利用10个随机引物,对21个代表菌株进行RAPD分析,结果表明,10个引物共获得179个DNA多态性片段,多态性检测率为100%;以遗传距离0.43为阈值时,将供试的21个菌株分为2个RAPD组,以遗传距离0.34为阈值时,属于AG-4融合群的菌株又可以分为2个RAPD组;隶属同一融合亚群的不同菌株间也存在丰富的遗传分化。说明RAPD分析结果能够反映茄科蔬菜丝核菌不同菌株间丰富的遗传分化现象。利用番茄对分离得到的39个丝核菌菌株进行了致病性测定,结果表明:隶属不同融合群的不同菌株其致病性强弱存在明显差异。同属于AG-4融合群的36个菌株也具有明显的致病力分化现象。总体看来,属于AG-4-HG-I融合亚群的菌株致病力较强,属于AG-4-HG-III融合亚群的菌株的致病力相对较弱。将AG-4-HG-I融合亚群各供试菌株的致病力分化结果与RAPD分析结果进行对比分析发现,菌株的RAPD分组（RG）与致病性分组（VG）无明显相关性。由此可见,RAPD分析虽然能够比较全面的反映供试立枯丝核菌菌株间的遗传分化,但是,对于探寻菌株间致病力的分化并不是一个有效手段。依据供试菌株rDNA-ITS区序列分析结果,针对AG-4融合群设计一对特异性引物,该引物特异性检测结果表明,只有属于AG-4融合群的丝核菌菌株扩增到一个约500bp的片段,属于其它融合群的丝核菌菌株及其它土传真菌病原如茄腐镰刀菌和终极腐霉菌都没有扩增到任何片段;利用该对引物从番茄立枯病罹病植株的发病部位成功检测到一个约500bp的片段,而从健康植株中没有检测到任何片段。此特异性引物为茄科蔬菜丝核菌病害的早期、快速诊断奠定了良好的基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 引言
• 1 茄科蔬菜丝核菌病害的研究进展
• 1.1 茄科蔬菜丝核菌病害研究概况
• 1.2 马铃薯立枯丝核菌病害的发病规律及影响因素
• 1.3 番茄、辣椒立枯丝核菌病害的发病规律及影响因素
• 1.4 茄科蔬菜苗期立枯病和茎腐病病原学研究现状
• 2 丝核菌分离方法研究进展
• 3 丝核菌的分类研究现状
• 3.1 丝核菌的国际分类框架
• 3.2 多核类丝核菌及融合群划分
• 3.3 双核丝核菌及其融合群的划分
• 4 分子生物学技术在丝核菌遗传多样性研究中的应用
• 4.1 DNA 分子标记技术在丝核菌遗传多样性研究中的应用
• 4.1.1 基于传统的 Southern 杂交技术的分子标记
• 4.1.2 随机引物扩增长度多态性分析（Random Amplification Polymorphism DNA RAPD）
• 4.1.3 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymophism, AFLP）
• 4.2 利用微卫星 DNA（Microsatellite）的多态性分析
• 4.3 β-微管（β-tubulin）蛋白基因在丝核菌研究中的应用
• 4.4 核糖体 RNA 基因在丝核菌分子系统学研究中的应用
• 4.4.1 核糖体 RNA 基因概况
• 4.4.2 真菌rDNA 特异性扩增的通用引物
• 4.4.3 rDNA 序列分析在丝核菌系统演化研究中的应用
• 4.4.4 rDNA-ITS区序列分析在植物真菌病害分子检测中的应用现状
• 4.5 实时荧光PCR（real-time PCR）技术在丝核菌研究中的应用
• 5 本研究的目的意义
• 第二章 茄科蔬菜立枯丝核菌的融合群鉴定及遗传多样性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 标本采集、菌株分离及菌丝融合鉴定
• 1.2 供试菌株 DNA 的提取
• 1.3 rDNA-ITS 区序列分析
• 1.4 茄科蔬菜立枯丝核菌致病性测定
• 1.5 供试菌株的 RAPD 分析
• 2 结果与分析
• 2.1 供试菌株的菌丝融合群鉴定
• 2.2 供试菌株5.8s rDNA-ITS 区序列分析
• 2.2.1 菌株5.8s rDNA-ITS 区基因的特异性扩增
• 2.2.2 克隆检测
• 2.2.3 供试菌株5.8s rDNA-ITS 序列分析
• 2.3 供试菌株的致病性测定
• 2.4 供试菌株的遗传分化及其与致病力相关性分析
• 2.4.1 供试菌株的 RAPD 分析
• 2.4.2 供试菌株的树状聚类图及聚类过程
• 2.4.3 供试菌株 RAPD 标记的遗传分化与致病性的关系
• 3 讨论
• 3.1 关于从土壤中分离丝核菌的方法问题
• 3.2 关于茄科蔬菜立枯丝核菌融合群组成问题
• 3.3 关于供试菌株 RAPD 多样性及其与致病力的关系问题
• 第三章 立枯丝核菌 AG-4 融合群的分子检测
• 1 材料和方法
• 1.1 供试试剂
• 1.2 供试仪器
• 1.3 引物设计区段的确定
• 1.4 引物的设计
• 1.5 立枯丝核菌不同融合群菌株及茄腐镰刀菌和终极腐霉 DNA 的提取
• 1.6 引物特异性验证
• 1.7 茄科蔬菜丝核菌病害的分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 特异性引物设计
• 2.2 特异性引物 PCR 反应条件
• 2.3 引物对 AG-4 融合群的分子检测
• 2.4 茄科蔬菜丝核菌病害的分子检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文