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宿主限制因子APOBEC3F抑制HIV-1病毒相关机制的研究

2020-12-28阅读(364)

宿主限制因子APOBEC3F抑制HIV-1病毒相关机制的研究

论文摘要

HIV-1病毒的感染是引起AIDS的主要原因,对HIV-1的治疗和预防也因此成为治疗AIDS的根本途径。HIV-1感染的有效治疗已经取得了显著成就,但仍面临一些挑战,如病毒耐药性以及病毒感染难以完全治愈等,因而继续研究更为有效的治疗策略十分必要。宿主中存在可以对HIV-1病毒产生限制作用的分子,被称为宿主限制因子,同时病毒也具有相对的拮抗措施而使限制因子无效。有关宿主限制因子与病毒间相互拮抗机制的研究能够为HIV-1的防治提供新的研究途径。以APOBEC3F和APOBEC3G为代表的APOBEC3蛋白家族是一类重要的HIV-1的宿主限制因子,它们可通过脱氨酶的致突变作用和非脱氨酶作用的机制限制病毒复制。但HIV-1可通过自身的Vif蛋白与APOBEC3F的相互作用引导其被降解限制其作用的产生。APOBEC3F被包装进入病毒颗粒是其发挥抗病毒作用的前提条件,本文首先对APOBEC3F的包装机制进行研究。对APOBEC3F缺失突变包装效果的分析显示,APOBEC3F的104-157位序列是其进入病毒颗粒的关键区域。同时,对HIV-1病毒Gag结构缺失突变的研究显示,与APOBEC3F包装进入病毒直接相关的区域是Gag的NC结构域。进一步的结果说明,NC的锌指结构以及第一锌指结构两侧的碱性氨基酸对APOBEC3F和APOBEC3G进入病毒均重要,同时竞争性包装实验结果也说明二者的包装机制存在较高相似性。上述工作阐明了APOBEC3F的104-156氨基酸与病毒Gag NC结构域的相互作用对包装过程起决定作用。除依赖脱氨酶机制外,APOBEC3蛋白也具有其他抑制HIV-1病毒的机制。APOBEC3F可以阻断HIV-1逆转录过程,但其具体机制还不明确。本研究中首先确定了在病毒颗粒内APOBEC3F和RT存在相互作用。APOBEC3F和RT各自的缺失突变结果明确了APOBEC3F的104-1 56位氨基酸以及RT的Thumb结构域是APOBEC3F和RT与相互作用关键区域。APOBEC3F 1-156仍具有较强抗病毒能力,且该活性与其脱氨酶活性无关。上述结果提示APOBEC3F的不依赖嘧啶脱氨酶活性的HIV-1抗病毒能力可能源于与RT的相互作用而影响逆转录过程。HIV-1的Vif蛋白可通过与APOBEC3F的相互作用引导其被降解等机制而消除其抗病毒作用。本文中采用模拟计算方式预测关键作用点。根据已报道的APOBEC3C的结构,通过同源性分析,建立了APOBEC3F碳端结构的模型。再通过与Vif模型模拟相互作用,可以对Vif与APOBEC3F作用面上的关键位点进行分析预测。预测结果通过生物学研究方法加以证实,确定了部分未见报道的APOBEC3F结构中与Vif作用的重要位点。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 第一部分 HIV-1宿主限制因子APOBEC3F包装进入病毒颗粒机制以及与APOBEC3G相关比较
  • 前言
  • 实验材料
  • 1. 细胞系
  • 3. 细胞培养基和生化试剂
  • 4. 试剂盒
  • 5. 抗体
  • 6. 质粒
  • 7. 主要实验仪器
  • 实验方法
  • 1. 细胞培养及转染
  • 2. 病毒或病毒类似颗粒的超速离心分离
  • 3. 免疫印迹（Western Blot）
  • 4. 免疫共沉淀（Co-IP）
  • 实验结果
  • 1. 病毒颗粒及类病毒颗粒VLPs的APOBEC3F包装
  • 2. APOBEC3F与Gag及其截短突变体相互作用研究
  • 3. APOBEC3F与Gag NC突变体作用研究
  • 4. APOBEC3F突变体对包装进入病毒颗粒的影响
  • 5. 细胞或病毒RNA在APOBEC3F/G包装过程中辅助作用研究
  • 6. APOBEC3F和APOBEC3G病毒包装机制比较
  • 7. Gag NC结构域突变体对APOBEC3F和APOBEC3G包装的影响
  • 讨论
  • 第二部分 APOBEC3F与HIV-1逆转录酶相互作用的抗病毒机制研究
  • 前言
  • 实验材料
  • 1. 细胞系
  • 2. 常用试剂
  • 4. 试剂盒
  • 5. 抗体
  • 6. 质粒
  • 7. 主要实验仪器
  • 实验方法
  • 1. 质粒构建
  • 2. 细胞培养及转染
  • 3. 细胞基因组提取
  • 4. 免疫印迹（Western Blot）
  • 5. 定量PCR（realtime PCR）检测
  • 6. HIV假型病毒的生产以及感染细胞
  • 7. 病毒p24抗体的定量检测
  • 8. 病毒感染性测定
  • 9. 免疫共沉淀（Co-IP）
  • 实验结果
  • 1. 定量PCR分析APOBEC3F抑制HIV-1病毒复制
  • 2. 逆转录酶与APOBEC3F相互作用的研究
  • 3. 确定逆转录酶和APOBEC3F作用的关键区域
  • 4. APOBEC3F与RT作用关键区域的确定
  • 5. APOBEC3F与RT作用关键区域抑制HIV-1活性研究
  • 6. 核酸分子对APOBEC3F与RT作用的影响
  • 讨论
  • 第三部分 APOBEC3F与HIV-1 Vif相互作用研究
  • 实验材料
  • 1. 细胞系
  • 2. 常用生化试剂
  • 4. 试剂盒
  • 5. 抗体
  • 6. 质粒
  • 7. 主要实验仪器
  • 实验方法
  • 1. 质粒构建
  • 2. 细胞培养及转染
  • 3. 免疫印迹（Western Blot）
  • 4. 免疫共沉淀（Co-IP）
  • 实验结果
  • 1. APOBEC3F与Vif作用模拟结构建立及关键位点预测
  • 2. APOBEC3F点突变抗Vif降解作用验证
  • 3. APOBEC3F点突变与Vif相互作用分析
  • 讨论
  • 参考文献
  • 宿主功能因子对丙型肝炎病毒感染作用研究进展
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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