论文摘要
手性（Chirality）是自然界的基本属性之一,无论是组成生物体的大分子,如蛋白质、核酸等还是自然界中的行星自转、大气气旋等现象几乎都具有手性特征。手性化合物在医药、农药等领域有着重要的作用,由于同一化合物的两个对映体之间不仅理化性质和药理方面有很大不同,两个对映异构体之间的生物活性也表现出显著差异。手性醇类化合物在合成手性药物、手性农药及高性能液晶材料等方面有重要的应用价值,因此合成单一手性醇类物质的研究具有十分重要的理论和实践意义。脂肪酶作为生物催化剂对拆分手性醇类化合物有很好的立体选择性,而且其催化反应条件温和、环境友好,已经广泛应用在手性拆分领域。但是由于游离脂肪酶作为催化剂还存在一些不足,如稳定性差、不易回收等,极大的限制了脂肪酶的工业应用。而采用固定化酶技术能够很好的解决这一难题,因此酶固定化方面的研究一直以来都是酶工程技术中的研究热点。溶胶—凝胶（sol-gel）法固定化酶技术是物理包埋过程,以有机或无机化合物（通常为烷氧化合物,如正硅酸甲酯TMOS或正硅酸乙酯TEOS）为前驱体,在液相下将前躯体与生物大分子均匀混合,经水解、缩聚反应,形成稳定透明溶胶体系,由溶胶状态逐渐固化,形成三维空间网络结构的凝胶的过程。溶胶-凝胶法分为水解和聚合、凝胶化、老化和干燥等几个步骤。溶胶—凝胶法固定生物大分子具有固定化过程高效性、良好的重复性及载体可修饰性等特点。本文首先将本实验室已获得的LipA工程菌,进行培养获得大量LipA粗酶,然后通过超声处理、硫酸钱沉淀、Hitrap Sepharose柱离子交换层析对脂肪酶LipA进行纯化,纯化后的脂肪酶LipA用于固定化研究。本文用不同硅烷前躯体进行研究,发现丙基三甲氧基硅烷和正硅酸乙酯为硅烷前躯体对脂肪酶LipA进行包埋,表现出最高的比活力。其中丙基三甲氧基硅烷与正硅酸乙酯的摩尔比、酶溶液量、交联剂的加入量等都是影响固定化酶活性的重要参数,本实验对这些因素进行了单独研究,丙基三甲氧基硅烷与正硅酸乙酯的摩尔比4/1、加酶量为300ul、交联剂的加入量是200ul、硅烷前躯体水解时间是30min,根据以上条件对脂肪酶LipA进行固定化其比活力是游离脂肪酶LipA的1.5倍。其次本文用固定化酶LipA对三种具有代表性结构的手性醇进行拆分反应。通过考察底物分子结构与固定化酶催化性能的关系,找到适合固定化脂肪酶LipA的拆分底物。实验发现该固定化酶对2-甲基-1-丁醇具有较高的催化活性,且立体选择性也较游离酶有所提高。同时也考察了不同链长的酰基供体、温度、pH、水活度等酶促2-甲基-1-丁醇转酯反应中的重要影响因素,在酰基供体是丁酸乙稀酯、反应温度是50℃、pH是9.5、水活度是0.54的最优实验条件下,固定化酶立体选择性最高E值为13.05,当反应转化率达到64.13%,剩余2-甲基-1-醇光学纯度可达到97%以上。本论文还对固定化酶LipA的重复使用性进行了研究,重复使用8次后固定化酶LipA仍然具有很高的活力,其相对活力是最初活力的70%。这种良好的重复使用性为固定化脂肪酶LipA在工业化的连续生产中的使用奠定了基础。