论文摘要
目的:呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus,RSV）广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。病毒感染机体后的免疫保护机制尚未明确,也无特异性防治方法。RSV融合糖蛋白（fusion glycoprotein,F）和吸附蛋白（attachment protein,G）是RSV仅有的两种中和抗原。由于G蛋白的差异,RSV有A和B两种抗原亚型。我国流行的RSV主要是以A亚型为主。考虑到RSV病毒结构和感染的特点,研究以共表达RSV A亚型G、F糖蛋白的非复制型重组腺病毒和DNA疫苗进行联合免疫预防RSV感染。采取这种抗原组合的优点在于:结构上类似减毒活疫苗,有助于诱导平衡的免疫反应;提高外源基因转移及表达效率;一次接种产生两种中和抗原,可改善接种效率,减少婴幼儿接种疫苗的创痛,降低疫苗成本。 共表达策略目前主要用于以疾病治疗为目的基因治疗领域,或用于表达异源多聚体蛋白的亚单位。用于疫苗研究的报道较少。美国BD Bioscience Clontech公司已经有商品化的真核双表达载体pIRES,但尚缺乏可方便地用于构建双顺反子共表达的腺病毒载体系统。为此,本研究利用内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）构建可用于双顺反子共表达的腺病毒重组体。 方法:本研究依据IRES的碱基序列,设计并合成一对特异性引物,以商品化的真核双表达载体pIRES为模板,扩增IRES及其调控序列IVS,克隆入T载体,获得pGEMT-IRES克隆载体（MCSA、MCVB分别位于IRES序列的上、下游）。根据IRES上、下游多克隆位点,设计并合成两对用于扩增目的基因的PCR引物,分别扩增出F基因和增强型绿色荧光蛋白基因（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）,分别克隆至pGEMT-IRES,获得重组质粒pGEMT-F/EGFP。为构建共表达RSV F和EGFP的非复制型腺病毒重组体,本研究采用了AdEasy系统。该系统是利用生长周期短,便于操作的E. coli BJ5183细胞完成腺病毒骨架质粒与克隆有外源基因的穿梭载体同源重组。在这一过程中,包括三个依次递进的步骤:将外源性基因（F-IRES-EGFP）亚克隆于穿梭载体pShuttle-CMV;重组穿梭载体与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在E. coli BJ5183细胞内同源
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标签：腺病毒重组体论文; 共表达论文; 增强型绿色荧光蛋白论文; 呼吸道合胞病毒融合蛋白论文; 内部核糖体进入位点论文;