论文摘要
帕金森病是常见的神经变性病,在中脑中存在特征性黑质多巴胺能神经元的丢失和路易小体的形成。路易小体中主要成份是纤维化的alpha突触核蛋白。研究认为,alpha突触核蛋白聚集形成纤维的过程是帕金森病发病机制中的关键步骤,而alpha突触核蛋白纤维的前体--寡聚体,被认为具有神经毒性。alpha突触核蛋白聚集的机制,以及防止其毒性是极其重要的研究热点之一。近年来,相关研究发现海藻糖通过与蛋白分子间的相互作用,可抑制神经变性病中相关蛋白的异常聚集。海藻糖还可以诱导自噬,从而增强对与帕金森病相关的alpha突触核蛋白A30P及A53T突变体的清除。我们通过在近似生理条件下孵育alpha突触核蛋白A53T突变体,构成alpha突触核蛋白纤维形成模型。观察海藻糖在alpha突触核蛋白纤维形成过程中是否有抑制聚集,甚至是解聚集的作用,从而为帕金森病治疗新思路提供前期实验依据。海藻糖对alpha突触核蛋白聚集的影响目的研究海藻糖对alpha突触核蛋白纤维化过程的作用。材料和方法alpha突触核蛋白A53T突变体（AS A53T）单独孵育7天,以及与不同浓度（10 mM和100 mM）的海藻糖共同孵育7天,用圆二色谱（CD）检测蛋白二级结构的变化,用硫磺素T（ThT）荧光观测蛋白聚集的形成,用原子力显微镜（AFM）观察蛋白聚集的形态变化。结果（1）AS A53T单独孵育时,首先出现CD图上198 nm处负值减少,219 nm处负值增加,ThT荧光的增强,AFM图上形成了“饼样”寡聚体,提示AS A53T先聚集成了含beta折叠的寡聚体。随着时间的延长,CD图上出现198 nm处负值继续减少,219 nm处负值继续增加。ThT荧光出现饱和状态,AFM图上AS A53T继续聚集成缠结或交联状大纤维,直至纤维块,提示AS A53T在后期形成了不可溶的纤维及纤维块。（2）10 mM海藻糖与AS A53T共孵育时,早期CD、ThT和AFM观察到的现象与AS A53T单独孵育时类似。但在后期CD图上出现198 nm处负峰峰值增加,219 nm处负值相应的减少,ThT荧光强度降低,AFM图上出现双链串珠样及很小的聚集体。提示AS A53T在孵育后期出现了无规则卷曲构象的增加,beta折叠的减少,说明10 mM海藻糖在早期不能抑制AS A53T聚集成寡聚体或原纤维,但在后期可以将已形成的寡聚体或原纤维,解聚成小的寡聚体,甚至是含无规则卷曲构象的物质。（3）100 mM海藻糖与AS A53T共同孵育可以发现CD在198 nm处负值逐渐减少,而在219 nm处负值逐渐增加,ThT荧光强度也逐渐增强,AFM图仅出了一些小的寡聚体和原纤维。说明100 mM海藻糖与AS A53T共孵育时,可减缓溶液中寡聚体的形成,稳定已形成的寡聚体或原纤维,防止进一步形成AS A53T纤维。结论1.在近似生理条件下,alpha突触核蛋白A53T突变体可形成寡聚体、原纤维,直至纤维及纤维斑块。2.低浓度海藻糖可以将已存在的alpha突触核蛋白A53T突变体原纤维和纤维,解聚集为小的寡聚体,甚至是含无规则卷曲构象的物质,也就是具有解纤维聚集作用。3.高浓度海藻糖可以减慢alpha突触核蛋白A53T突变体寡聚体的形成,稳定已形成的寡聚体或原纤维,防止进一步形成alpha突触核蛋白A53T突变体纤维。
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