胸腺肽β4（Tβ4）的生物合成及其相关研究

论文摘要

胸腺肽β4（Tβ4）是β胸腺肽家族的一员,由43个氨基酸残基组成,N-末端Ser残基位点被乙酰化修饰,具有多重生物学功能,在组织再生、重塑、创伤愈合、维持肌动蛋白平衡、肿瘤发病与转移、细胞凋亡、炎症、血管生成、毛囊发育等生理、病理过程中扮演着极为重要的角色。美国雷根内克斯公司化学合成出Tβ4对其作为治疗用药的研究已经进入Ⅱ期临床阶段。由于生物提取和化学合成的局限性,人们尝试生物制备Tβ4,但生物合成存在两大难点,乙酰化修饰和小分子多肽的表达,因此未能获得与天然结构一致的Tβ4。本研究中,将其编码基因融合在一种分子量极小的Spl DnaX Intein（136个氨基酸残基,来源于Spirulina platensis）的N端,同时在Intein的C端添加His标签,构建融合表达载体pET-Tβ4-Intein,将其与乙酰化酶表达载体pACYC-nat共转至BL21（DE3）中,得到N-末端乙酰化修饰的Tβ4-intein融合蛋白。由于该Intein的C末端残基Asn突变为残基Ala,阻断了剪接反应,在体外用巯基乙醇诱导融合蛋白发生N端切割,获得具有N-末端乙酰化修饰的Tβ4。目的蛋白经过疏水,反相和阴离子交换层析进一步纯化,经过RP-HPLC分析,最后用Q-TOFMS和Q-TOF MS/MS质谱鉴定其精确分子量和乙酰化修饰位点,最终获得了与天然结构一致的Tβ4。同时利用该方法制备了Tβ4的三个突变体。此方法重复性高,得率较好,平均每升培养液中能获得纯度超过96.7%的目的蛋白61.79mg,具有应用前景。在体外Tβ4及其三个突变体均可与肌动蛋白结合。本工作为进一步研究Tβ4的功能和应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 胸腺肽β4（Tβ4）
• 1.2 蛋白质/多肽N-末端乙酰化修饰
• 1.3 生物制备小分子多肽
• 1.4 课题目标
• 第二章 Spl DnaX Intein介导融合蛋白自我切割制备TB4及其三个突变体
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 Tβ4及其三个突变体的生物活性分析和比较
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 作者简介