来源于里氏木霉的未知Expansin-like蛋白的异源重组表达研究

论文摘要

Expansin是近年来发现的迄今惟一能诱导热钝化的离体细胞壁伸展的细胞壁特异性植物内源蛋白质。在一些可侵染或消化植物组织的生命体中也发现了一些类似于expansin的蛋白,被称作expansin-like蛋白。自从expansin蛋白家族发现至今,虽然人们一直尝试在外源表达系统中表达expansin蛋白及expansin-like蛋白,但始终没有成功的报道。近年来人们将注意力集中于寻找微生物来源的expansin-like蛋白,并尝试将其在外源表达系统中重组表达,寄希望其能够代替expansin应用于工业生产中。本论文对里氏木霉Trichoderma reesei来源的未知expansin-like蛋白基因进行了研究,经过数据库比对分析,该蛋白为首次发现的来源于T.reesei的expansin-like蛋白。我们将该基因克隆到E.coli表达系统和毕赤酵母表达系统中进行了异源重组表达,结果显示,虽然该基因能够在E. coli表达系统中有可溶性重组蛋白的表达,但是表达量很低,以木聚糖及阿拉伯木聚糖为底物均检测不到水解酶活性,且检测不到任何expansin-like蛋白活性。由于扩增得到的expansin-like蛋白氨基酸序列与原始Edmam降解法测序获得的两个氨基酸序列YNEAGIWTPKNVF和IYNAEAWYNIVHTGWV有两个氨基酸差异,故合成了氨基酸回复突变的expansin-like基因,回复突变的基因在E. coli表达系统中也有可溶性重组蛋白的表达,但是重组表达的蛋白质依然没有任何expansin-like蛋白活性和多糖水解酶活性,可见该基因在E.coli表达系统中异源重组表达无活性并不是由于氨基酸差异导致的,多肽链的错误折叠及蛋白的糖基化作用等可能是导致重组蛋白表达没有活性的原因。该expansin-like蛋白基因不能在毕赤酵母表达系统中重组表达,在培养基及细胞裂解液中均不能检测到目的蛋白,培养基及细胞裂解液也检测不到相应的水解酶活性及expansin-like蛋白活性。由于该基因来源于丝状真菌,含有大量稀有密码子,我们尝试对该基因序列进行针对毕赤酵母表达系统的密码子优化,但是经过密码子优化的expansin-like蛋白在毕赤酵母表达系统中依旧没有表达。所以,稀有密码子并非导致Trel基因在毕赤酵母表达失败的原因,可能原因是mRNA转录过程的提前终止。所以,我们构建了里氏木霉表达载体,利用里氏木霉强启动子pCBHI,尝试在更高级的丝状真菌表达系统中进行重组表达,以期获得重组的expansin-like蛋白,从而进一步的对这个新的expansin-like蛋白的理化,酶学性质进行研究。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第一节 Expansin的发现和作用机制
• 1 植物细胞壁的"酸生长"现象
• 2 Expansin的发现
• 3 Expansin-like蛋白的发现
• 4 Expansin的蛋白结构
• 5 Expansin的作用机制
• 第二节 多糖降解酶和expansin蛋白的异源重组表达研究概况
• 1 在细菌中的表达情况
• 2 在酵母中的表达情况
• 2.1 在酵母表达系统中的表达
• 2.2 在毕赤酵母中的表达情况
• 3 纤维素酶在丝状真菌中的表达
• 4 各种表达系统表达纤维素酶的优缺点比较
• 第三节 本论文研究的目的和主要内容
• 第二章 木霉来源的未知expansin-like蛋白的E.coli异源重组表达
• 第一节 木霉来源的未知expansin-like蛋白Tre1原核异源重组表达载体构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 质粒
• 1.1.3 培养基
• 1.2 主要试剂及来源
• 1.3 主要仪器设备及其来源
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 引物设计与合成
• 1.4.2 不含信号肽的Tre1 cDNA的PCR扩增
• 1.4.3 琼脂糖凝胶电泳胶回收DNA片段
• 1.4.4 TB法（Terrific Broth）抽提质粒
• 2法制备感受态细胞'>1.4.5 CaCl₂法制备感受态细胞
• 1.4.6 DNA连接反应
• 1.4.7 感受态细胞的热激转化和稀释涂布
• 1.4.8 重组菌的筛选和鉴定
• 2 结果
• 第二节 Tre1基因的原核重组表达及其分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.2 主要试剂及来源
• 1.3 主要仪器设备及其来源
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 重组菌的诱导表达
• 1.4.2 粗蛋白的制备
• 1.4.3 亲和层析纯化带有His-tag标签的目的蛋白
• 1.4.4 透析法将初步纯化的重组酶进一步提纯
• 1.4.5 DNS法测Tre1水解酶活性
• 1.4.6 蛋白浓度测定
• 1.4.7 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.4.8 Western blot
• 2 结果与讨论
• 2.1 Tre1在E.coli中的重组表达
• 2.2 重组酶Tre1粗酶液的活性测定与纯化
• 2.3 Tre1 opt1基因在E.coli表达系统的表达情况
• 2.4 重组表达Tre1蛋白肽指纹图谱分析
• 第三节 本章小结
• 第三章 木霉来源的未知expansin-like蛋白在毕赤酵母中的重组表达
• 第一节 木霉来源的未知expansin-like蛋白Tre1原核异源重组表达载体构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.2 主要试剂及来源
• 1.3 主要仪器设备及其来源
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 采用TB法（Terrific Broth）大量抽提质粒
• 1.4.2 毕赤酵母氯化锂转化法
• +及Mut^s转化子'>1.4.3 筛选Mut⁺及Mut^s转化子
• 1.4.4 酵母基因组提取
• 2 结果与讨论
• 2.1 木霉来源的未知expansin-like蛋白Tre1毕赤酵母表达质粒的构建
• 第二节 Tre1在毕赤酵母表达系统中的重组表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 裂解缓冲液
• 1.2 主要试剂及来源
• 1.3 主要仪器设备及其来源
• 1.4 实验方法
• +的分泌表达'>1.4.1 pPICZαA-Tre1-GS115重组酵母菌Mut⁺的分泌表达
• 1.4.2 毕赤酵母细胞裂解
• 2 结果与讨论
• 2.1 Tre1在毕赤酵母表达系统中的重组表达
• 2.2 Tre opt1在毕赤酵母表达系统中的重组表达
• 第三节 本章小结
• 第四章 Tre1基因在里氏木霉表达系统异源重组表达体系的构建
• 第一节 Tre1基因在里氏木霉表达系统异源重组表达体系的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.2 主要试剂及来源
• 1.3 主要仪器设备及其来源
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 T.reesei的培养
• 1.4.2 T.reesei基因组DNA的制备
• 1.4.3 PCR扩增获得CBHI启动子序列及终止序列
• 1.4.4 overlap PCR构建pCBHI-Tre1/pAN7-1表达载体
• 2 结果与讨论
• 第二节 本章小结
• 参考文献
• 致谢