基于L-精氨酸骨架的氨肽酶N抑制剂的设计、合成及活性研究

论文摘要

氨肽酶N（APN）是一类膜型锌离子依赖性的外肽酶,在很多组织如小肠、肾、肝以及中枢神经系统中都有广泛分布。该酶参与了营养素的最终水解和生物活性分子如脑啡肽和内啡肽的降解失活。另外,氨肽酶N也是冠状病毒的受体,并参与了抗原递呈的过程。更为重要的是,Saiko等人确定氨肽酶N在肿瘤细胞表面高水平表达,被称作肿瘤细胞标记物或相关抗原CD13。它在肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和新生血管的生成等过程中发挥着关键作用。因此氨肽酶N成为抗肿瘤药物研究的一个重要靶点。到目前为止人源氨肽酶N的晶体结构未见报道。2006年Kiyoshi等人报道了大肠杆菌氨肽酶N（eAPN）以及eAPN与其特异性抑制剂Bestatin共结晶复合物的晶体结构。eAPN的晶体结构表明氨肽酶N活性区域至少包含有一个阴离子结合位点和三个疏水性口袋。三个疏水性口袋分别是位于锌离子左侧的S1口袋和右侧的S1’和S2’口袋。这为氨肽酶N抑制剂的合理药物设计奠定了基础。本研究以氨肽酶N为靶点,基于Bestatin与eAPN作用模式,通过计算机辅助药物设计,构建出抑制剂的药效团模型,然后结合文献调研和本课题组已有的研究成果确定以L-精氨酸为母体骨架。在构建的L-精氨酸母核的结构基础上,根据eAPN的三维结构要求,将其侧链进行结构衍生化。在合成目标化合物之前,首先利用SYBYL7.0中的FlexX软件对所设计的化合物进行了对接打分,结果显示大部分化合物分值都接近于甚至超过阳性对照Bestatin。这说明了我们设计思路的合理性,为我们的研究提供了理论依据。本研究的合成工作以L-精氨酸为起始原料,首先将L-精氨酸的胍基用硝基保护,再将其羧基进行甲酯化保护得到关键中间体,然后将中间体与芳酰氯,芳磺酰氯,芳酸,Boc保护的氨基酸或者各种类二肽缩合,最后将羧酸甲酯转化成异羟肟酸,脱Boc保护基得到两个系列的目标化合物,即类二肽化合物（A系列）和类三肽化合物（B系列）。本文共设计、合成了107个目标化合物,并通过红外光谱、核磁共振氢谱、电喷雾质谱,高分辨质谱等方法对化合物结构进行了确证。经文献检索证明,所合成的目标化合物均为新型化合物,未见报道。对目标化合物进行了体外抑酶实验、体外抑制HL-60、K562、ES-2、A549、PLC及H7402细胞增殖实验,体内动物抑瘤实验等,以期筛选出高活性的氨肽酶N抑制剂。体外抑酶实验结果显示,B系列化合物相对于A系列化合物活性有所提高,且两个系列的化合物对APN的抑制活性都优于MMP-2。A系列中的A18和A21活性较好,IC50达到了5.3和5.1μM(Bestatin,IC50=3.1μM)。B系列化合物中B47,B50和B52的IC50分别达到了64.8,53.4和59.0μM,接近于阳性对照Bestatin(IC50=51.8μM)。MTT法体外细胞实验测定了体外抑酶活性较好的11个化合物对高表达APN/CD13的HL-60、ES-2、A549、PLC细胞以及低表达APN的K562、H7402细胞的增殖抑制活性,实验结果表明我们的化合物对APN高表达的细胞都有较好的抑制作用,对于APN低表达的H7402细胞抑制作用比较差,但是对另外一种APN低表达的细胞K562的抑制活性却比较好,其原因还有待于进一步的研究分析。化合物A22对于六种肿瘤细胞都显示出了很好的活性,可以对其进行进一步的体内动物实验研究。体内动物抑瘤实验选取了体外抗细胞增殖作用好的A22,B46,B50和B52四个化合物进行研究,实验结果表明化合物A22和B50能明显减少荷肝癌H22小鼠的肺部结节数目,即能明显抑制癌细胞的转移,抑制率也超过了阳性对照药Bestatin,分别达到了61.50%和71.39%（Bestatin的抑制率为58.04%）。本文在所有化合物活性实验结果的基础上,利用计算机软件进行了初步定量构效关系的研究。构建了QSAR模型,对于指导以后同类化合物的结构优化有一定的指导作用。本研究的主要创新点是:①基于eAPN的晶体结构及Bestatin与eAPN的作用模式,利用计算机软件辅助设计合成了一系列未见文献报道的基于L-精氨酸骨架的衍生物,合成路线设计合理,原料经济易得。②大多数化合物在体外表现出较好的抑酶活性以及抑制各种肿瘤细胞增殖的活性。化合物A22和B50还表现出比阳性对照Bestatin更好的体内动物抑瘤活性。③基于化合物的结构和活性数据建立了有一定预测能力的定量构效关系模型,为今后氨肽酶N抑制剂的研究提供了指导和帮助。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACTS
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 氨肽酶N研究的历史回顾
• 1.2 氨肽酶N/CD13的结构
• 1.2.1 一级结构
• 1.2.2 二级结构
• 1.2.3 三级结构
• 1.3 氨肽酶N的组织分布
• 1.4 氨肽酶N/CD13的生理功能
• 1.4.1 蛋白水解酶的作用
• 1.4.2 作为CD13免疫抗原的作用
• 1.4.3 与肿瘤发生和转移的关系
• 1.4.4 氨肽酶N作为冠状病毒受体
• 1.5 氨肽酶N水解底物的作用机制
• 1.6 氨肽酶N的抑制剂
• 1.6.1 氨肽酶N单抗
• 1.6.2 氨肽酶N配体
• 1.6.3 氨肽酶N抑制剂研究进展
• 1.6.3.1 天然抑制剂
• 1.6.3.2 小分子合成抑制剂
• 1.6.3.2.1 小分子类肽抑制剂
• 1.6.3.2.2 小分子非肽抑制剂
• 参考文献
• 第二章 氨肽酶N抑制剂的合理药物设计
• 2.1 氨肽酶N的活性位点及抑制剂的作用模式
• 2.1.1 氨肽酶N的活性位点
• 2.1.2 氨肽酶N抑制剂的作用模式
• 2.2 基于氨肽酶N结构的合理药物设计
• 2.2.1 L-精氨酸母核的选择
• 2.2.2 化合物的设计与FlexX打分
• 参考文献
• 第三章 目标化合物的合成
• 3.1 类二肽系列化合物的合成（A系列）
• 3.1.1 合成路线
• 3.1.2 实验部分
• 3.1.2.1 化合物A1-A25的合成
• 3.1.2.2 化合物A26,A27的合成
• 3.1.2.3 化合物A28-A55的合成
• 3.2 类三肽系列化合物的合成（B系列）
• 3.2.1 合成路线
• 3.2.2 实验部分
• 3.2.2.1 化合物B1-B42的合成
• 3.2.2.2 化合物B43-B52的合成
• 3.3 实验讨论
• 3.3.1 氨基酸甲酯盐酸盐的制备
• 3.3.2 氨基酸的叔丁氧羰酰化
• 3.3.3 类二肽的合成
• 3.3.4 类三肽的合成
• 3.3.5 甲酯的异羟肟酸反应
• 3.3.6 N-叔丁氧羰基的脱去反应
• 参考文献
• 第四章 目标化合物的生物活性评价
• 4.1 体外抑酶实验
• 4.1.1 目标化合物抑制氨肽酶N的活性实验
• 4.1.1.1 实验原理
• 4.1.1.2 材料与方法
• 4.1.1.3 氨肽酶N活性分析
• 4.1.1.4 抑制氨肽酶N活性实验
• 4.1.2 目标化合物抑制明胶酶的活性实验
• 4.1.2.1 实验原理
• 4.1.2.2 材料与方法
• 4.1.2.3 明胶琥珀酰化
• 4.1.2.4 明胶酶活性测定及抑酶实验
• 4.1.3 抑酶实验结果
• 4.1.3.1 类二肽系列衍生物
• 4.1.3.2 类三肽系列衍生物
• 4.2 目标化合物抑制HL-60,K562,ES-2,A549,PLC,H7402等肿瘤细胞增殖的实验
• 4.2.1 原理
• 4.2.2 材料与方法
• 4.2.3 实验结果
• 22小鼠肿瘤细胞转移实验'>4.3 目标化合物抑制荷肝癌H₂₂小鼠肿瘤细胞转移实验
• 4.3.1 原理
• 4.3.2 材料与方法
• 4.3.3 实验结果
• 参考文献
• 第五章 目标化合物的构效关系研究
• 5.1 模板化合物的选择及构象确定
• 5.1.1 材料与方法
• 5.1.2 确定对接条件
• 5.1.3 模板化合物的对接及分子叠合
• 5.2 氨肽酶N抑制剂的QSAR研究
• 5.2.1 比较分子场分析（CoMFA）
• 5.2.2 材料与方法
• 5.2.3 CoMFA模型的构建
• 5.2.4 CoMFA模型的验证
• 5.2.5 CoMFA模型的分析
• 5.3 结论
• 参考文献
• 第六章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.1.1 目标化合物的设计
• 6.1.2 目标化合物的合成
• 6.1.3 目标化合物的活性筛选
• 6.1.4 目标化合物的构效关系
• 6.2 展望
• 6.2.1 化合物结构的优化
• 6.2.2 化合物的活性筛选
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文目录
• 1H-NMR图谱'>附录Ⅰ 部分化合物的IR,ESI-MS,HRMS,¹H-NMR图谱
• 附录Ⅱ 外文文章
• 学位论文评阅及答辩情况表