肝癌患者外周血中微量肝癌细胞的检测及临床意义

论文摘要

原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、侵袭性强、易转移、预后差等特点。大量研究表明,循环系统中微量转移的肿瘤细胞是影响预后的一个重要因素。本研究通过联合免疫磁珠筛选细胞技术和巢式反转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR）技术,期望建立一种早期检测肝癌患者外周血中微量转移肿瘤细胞的方法,为肝癌这一严重危害人类健康和生命的疾病的诊断、治疗和预后判断等提供科学依据。在2003年9月至2004年12月止,我们主要从宁波市第一医院和宁波市传染病医院采集了91例患者外周血3mL,其中HCC患者43例,肝硬化患者（Liver cirrosis,LC）16例,肝炎患者20例,转移性肝癌患者6例,肝癌术后患者6例。血样的采集均获得病人的知情同意。同时我们分别采取了18名健康自愿者外周血各3mL作为阴性对照。我们联用Ficoll密度梯度离心与阴性、阳性免疫磁珠技术首先在患者的外周血中进行癌细胞的富集,然后运用巢式RT-PCR技术检测甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP ） mRNA,最后用Bio-Rad的定量分析软件进行半定量分析。在用肝癌细胞系HepG2所做的3组预实验中,我们发现阴性、阳性免疫磁珠联用增强了实验的灵敏度、特异性,其灵敏度为5mL血中含有一个癌细胞。在临床样品的实验中,我们发现在HCC、LC、肝炎、转移性肝癌以及肝癌术后患者的外周血中,AFP mRNA的阳性检出率分别为72.1%、43.8%、25.0%、100%以及66.7% （HCC vs LC,P<0.05;HCC vs肝炎,P<0.01）。同时通过半定量分析发现,HCC患者外周血AFP mRNA的水平显著高于非HCC患者（LC和肝炎患者）,而健康对照的血样中基本未能检测到AFP mRNA。在相关临床数据分析中,我们发现血清AFP并不与外周血AFP mRNA的阳性检出率及其表达量有关。在外周血AFP mRNA阴性和阳性的2组HCC患者间,反映肝脏功能的丙氨酸转氨酶（alanine transaminase , ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase,AST）、γ-谷氨酸转肽酶（gamma-glutamyl transpeptidase,GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的值不具统计学意义（P>0.05）。

论文目录

• 第一篇 综述部分
• 第1章 前言
• 第2章 原发性肝癌（HCC）的分子标记
• 1. 甲胎蛋白
• 2. 铁蛋白
• 3. 癌胚抗原
• 4. 细胞角蛋白
• 5. 金属蛋白酶
• 6. 血清酶的测定
• 7. 其它
• 第3章 分子诊断方法
• 1. 细胞富集技术
• 2. 分子检测技术
• 2.1. 反转录聚合酶链反应
• 2.2. 流式细胞技术
• 2.3. 甲基化DNA 技术
• 第4章 展望
• 第二篇 实验部分
• 第1章 材料和方法
• 1. 主要实验材料
• 2. 主要溶液
• 3. 主要仪器
• 4. 实验方法
• 第2章 实验结果
• 1. 免疫磁珠富集HepG2 细胞
• 2. HepG2 细胞预实验结果
• 3. 不同肝病患者（CAH、LC、HCC）外周血中AFP mRNA 的比较
• 4. 外周血中血清AFP 水平和AFP mRNA 的关系
• 5. 外周血中AFP mRNA 与几个反应肝功能的临床指标（ALT, AST, GGT, ALP, 血清AFP）之间的联系
• 第3章 讨论
• 参考文献
• 在读期间已发表和待发表的论文
• 致谢