论文摘要
目的:肾间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis,TIF）是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理特征。肾间质成纤维细胞的大量增殖、表型转化,和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积是引起肾间质纤维化的主要原因。ECM的增多又与成纤维细胞的大量增殖和其他细胞表型转化密切相关,而α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）则是细胞表型转化的标志。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是一种多功能的细胞因子,可促进ECM的合成,同时抑制其降解,并促进肾间质成纤维细胞的增殖,参与肾间质纤维化。肾上腺髓质素（adrenomedullin,ADM）是由52个氨基酸组成的多肽,属于一种强力的血管扩张剂。近期研究表明,ADM可以抑制TGF-β1刺激胶原合成和分泌,具有抑制纤维化的作用。中药红花（Safflower）在传统中医理论中具有活血祛瘀、消肿止痛的功效。ECM在肾组织中的大量聚积,用中医理论解释属于肾络瘀阻,当用活血祛瘀法,所以采用具有活血祛瘀通络作用的红花治疗。现代药理研究表明,中药红花不仅可以改善血液循环,还通过其他机制减轻肾小管间质纤维化,延缓慢性肾功能衰竭的进展。而红花防治肾小管间质纤维化的作用与抑制TGF-β1的表达有密切关系,但是否通过ADM抑制TGF-β1这一途径,尚缺乏有力的证据。本实验应用红花对单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction ,UUO）诱导的肾间质纤维化大鼠模型进行干预性治疗,并以血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦（Valsartan）为对照,旨在通过观察红花对实验动物患侧肾脏组织形态学及分子免疫学的影响,探讨中药红花对肾间质纤维化的拮抗作用及作用机理。方法:本实验研究选用雌性SD大鼠40只,适应性饲养1周后,分别置代谢笼里取尿,测定尿蛋白及尿红细胞全部阴性,随机分为4组:假手术组（Sham group）、模型组（UUO group）、缬沙坦组（UUOV group）、红花组（UUOS group）,每组10只。除假手术组外,各组动物结扎左侧输尿管并在术前1天灌胃给药。假手术组与模型组分别灌入等量的生理盐水,于实验第10天全部杀检,取左侧肾脏进行病理学观察,并分别采用免疫组化及原位杂交方法检测组织中α-SMA、III型胶原（Col III）、TGF-β1和ADM的蛋白表达以及ADM mRNA的表达。结果:1肾脏一般情况、肾重/体重（KW/BW）、血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）检测结果:假手术组左侧肾脏形态、大小无明显变化,模型组及各治疗组左侧梗阻肾脏体积均明显增大,重量增加,肾组织变薄。模型组（0.0137±0.0045）、缬沙坦组（0.0139±0.0048）及红花组（0.0132±0.0056）的肾重/体重比率与假手术组（0.0034±0.0002）比较有显著性差异（p<0.001,p<0.001,p<0.001）,但模型组及各治疗组之间的肾重/体重比率无显著性差异（p>0.05,p>0.05,p>0.05）。血尿素氮测定结果显示,模型组（12.07±4.71）明显高于假手术组（6.92±1.13）（p<0.01）,缬沙坦组（8.18±1.42）、红花组（8.61±1.61）与模型组比较显著降低（p<0.01,p<0.01）,其中缬沙坦组低于红花组,但无统计学意义（p>0.05）。血肌酐测定结果显示,模型组（103.88±28.43）明显高于假手术组（77.22±14.24）（p<0.01）,模型组及各治疗组之间比较,模型组最高,红花组（91.21±15.51）次之,缬沙坦组（85.49±20.29）最低,但三组之间无显著性差异（p>0.05,p>0.05,p>0.05）。2肾组织HE及天狼猩红染色显示:模型组间质大量炎细胞浸润和纤维组织增生,肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张,肾小球数目明显减少,面积缩小。肾小囊粘连或扩张,小囊周围大量纤维组织增生。各治疗组间质可见多少不等的炎细胞浸润,少量纤维组织增生,肾小管轻度扩张,部分肾小球轻度萎缩,小囊扩张,肾小球数量无明显改变。3肾组织中ADM蛋白含量的测定结果:假手术组（9.587±1.83）肾组织ADM蛋白含量最高,其它各组与之相比均明显降低（p<0.001,p<0.001,p<0.001）。模型组（4.606±0.38）及各治疗组之间比较,缬沙坦组（5.81±1.94）ADM蛋白含量最高,红花组（4.69±0.60）次之,模型组最低,但三组之间无显著性差异（p>0.05,p>0.05,p>0.05）。4 ADM蛋白的表达、分布及半定量分析结果:假手术组大鼠在肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达。与假手术组ADM的阳性面积及积分光密度值（ 3325.7±377.78 ,4.49±0.38）比较,模型组（1364.75±277.43,1.18±0.13）表达显著减弱（p<0.001）。红花组（2330.3±302.86,3.90±0.39）和缬沙坦组（2305.9±281.84,3.76±0.28）与模型组相比ADM的阳性面积及积分光密度值均呈显著性升高（p<0.001,p<0.001）,提示红花、缬沙坦均能上调ADM蛋白的表达。其中红花组优于缬沙坦组,但无显著性差异（p>0.05）。5 ADM mRNA的表达、分布及半定量分析结果:假手术组大鼠的ADM mRNA在肾小管上皮细胞中呈强阳性表达,模型组ADM mRNA的阳性面积及积分光密度值（294.6±46.39,1.29±0.89）与假手术组（13829.75±1224.49,10.37±0.49）相比显著减弱（p<0.001）。红花组（3311.65±511.12,2.93±0.16）和缬沙坦组（3195.85±621.54,2.76±0.20）与模型组相比ADM mRNA的阳性面积及积分光密度值均呈显著性升高（p<0.001,p<0.001）,提示红花、缬沙坦均能调控梗阻侧肾组织中ADM的mRNA表达。其中红花组优于缬沙坦组,但无显著性差异（p>0.05）。6 TGF-β1蛋白的表达、分布及半定量分析结果:假手术组在肾小管上皮细胞及肾小球内可见TGF-β1蛋白的弱阳性表达。其余各组表达均显著增强,见于肾小管上皮细胞、间质细胞及肾小球内。其中,模型组（20104.9±3492.40,59.61±6.69）较假手术组（1962.8±177.07,7.7±0.49）TGF-β1的阳性面积及积分光密度值均呈显著性升高（p<0.001）。缬沙坦组（11367.3±1831.09,40.67±4.15）、红花组（9207.9±1559.12,39.22±3.75）与模型组相比,TGF-β1的阳性面积及积分光密度值均呈显著性下降（p<0.001,p<0.001）,提示红花、缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中TGF-β1的蛋白表达。其中,红花组优于缬沙坦组,两组间的阳性面积有显著性差异（p<0.01）,而积分光密度值无显著性差异（p>0.05）。7α-SMA蛋白的表达、分布及半定量分析结果:假手术组α-SMA仅在血管壁见到阳性表达,肾间质及肾小管上皮细胞胞浆内未见表达。模型组（19745.9±3822.25,59.07±6.11）α-SMA阳性表达明显增强,主要见于肾间质,与假手术组（1997.6±291.59,7.58±0.49）比较有显著性差异（p<0.001）。缬沙坦组（ 11369.9±1930.25 , 41.22±4.09 ）、红花组（9141.5±1526.52,40.85±5.06）α-SMA阳性表达明显减弱,与模型组比较有显著性差异（p<0.001,p<0.001）,提示红花、缬沙坦均可有效抑制肾间质细胞的表型转化。红花组α-SMA阳性表达较缬沙坦组弱,两组间的阳性面积有显著性差异（p<0.01）,而积分光密度值无显著性差异（p>0.05）。8 Col III蛋白的表达、分布及半定量分析结果:Col III主要表达于肾间质。假手术组大鼠肾间质Col III呈弱阳性表达,其余各组表达显著增强,为条索状或成片块状。其中,模型组（5114.5±315.69,77.44±8.86）与假手术组（455.4±34.57,10.02±0.96）相比Col III的阳性面积及积分光密度值均呈显著性升高（p<0.001）。缬沙坦组（3520.5±421.74,51.14±3.50）、红花组（2406.95±375.24,43.26±3.48）与模型组相比,Col III的阳性面积及积分光密度值均呈显著性下降（p<0.001,p<0.001）,提示红花、缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中Col III的蛋白表达。其中,红花组明显优于缬沙坦组,而且有显著性差异（p<0.001）。9各组大鼠肾间质纤维化面积半定量分析结果:模型组（ 7448.2±922.92 ）肾间质纤维化程度较假手术组（ 854.8±92.26 ）明显加重（ p < 0.001 ）。缬沙坦组（5133.4±546.43）、红花组（4205.8±512.19）与模型组比较,肾间质纤维化面积明显减少（p<0.001,p<0.001）,提示红花及缬沙坦均有拮抗肾间质纤维化的作用。而且,红花组明显优于缬沙坦组,有显著性差异（p<0.001）。结论:1.红花能减轻肾组织的病理损害,减少病变肾组织ECM成分的积聚,延缓间质纤维化的进程。2.红花能下调肾组织TGF-β1蛋白的表达,抑制肾组织中细胞表型的转化,减少肾间质中MyoF的形成,从而使病变肾组织ECM合成减少。3.红花能刺激梗阻侧肾组织中ADM及其mRNA的表达,从而通过其生物学效应对肾间质纤维化起拮抗作用。
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