论文摘要
A类清道夫受体（Class A scavenger receptor, SR-A）是一种主要表达于巨噬细胞的模式识别受体,在机体的自然免疫中发挥重要作用。SR-A还与多种疾病的发生密切相关,其调控的异常是许多重要疾病的重要病理生理学基础。SR-A主要以吞噬多种多样的配体而实现自身的功能。然而,SR-A内吞路径的分子机制目前尚不知晓。本课题分别应用SR-A的两个特异性配体—乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）和岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan）,深入探讨了SR-A的不同内吞路径及其耦联的下游信号通路,揭示了不同内吞路径所具有的生物学意义,为阻止巨噬细胞凋亡、防止脂质在细胞中的过度积聚提供了新的干预靶点。细胞膜受体介导的受体配体复合物的内吞主要有两种形式:网格蛋白依赖型和小凹蛋白依赖型内吞路径。本课题首先想澄清,SR-A的内吞路径是什么?我们通过免疫共沉淀实验证实,SR-A在RAW264.7巨噬细胞中可以分别与网格蛋白或者小凹蛋白-1相互结合。进一步应用间接免疫荧光实验观察到,SR-A与网格蛋白或小凹蛋白-1共定位于RAW264.7细胞中。上述结果提示,SR-A可能同时依赖两种内吞路径进入细胞。接着我们想知道,SR-A这两条内吞路径的生物学意义是什么?为此,我们分别运用了两种方法特异性地阻断这两条内吞路径:一是通过SiRNA分别下调两条内吞路径中的关键结构蛋白—网格蛋白和小凹蛋白-1,从而阻断相应的内吞路径;二是运用特异性化学阻断剂氯丙嗪（CP）或nystatin,分别直接阻断相应的内吞路径。结果我们发现,当用SiRNA的方法网格蛋白下调约65%后,流式检测RAW264.7细胞内吞acLDL的能力约被抑制60%,而小凹蛋白-1表达下调约60%时,acLDL的内吞大约抑制25%。使用内吞化学阻断剂重复这一实验,得到了基本一致的结果,说明acLDL可能主要通过网格蛋白路径进入细胞。SR-A的另一重要功能为介导巨噬细胞的凋亡,为此我们还用同样的方法检测了不同内吞路径对SR-A介导的巨噬细胞凋亡的影响。结果显示,当网格蛋白下调时,SR-A介导的巨噬细胞凋亡减少约11%-16%;而小凹蛋白-1表达下调时,SR-A介导的巨噬细胞凋亡下降约58%-78%。因此,SR-A介导的巨噬细胞凋亡可能主要通过小凹蛋白路径实现。为了进一步阐明SR-A内吞路径耦联的下游信号通路,我们又进行了以下研究。首先,我们分别检测了acLDL和岩藻多糖分别与受体结合以及随后的内吞两种情形下SR-A下游信号分子的激活情况。Western blot检测发现,在内吞时无论acLDL还是岩藻多糖都可以激活MAPKs （p38, JNK, ERK）三个信号分子;但在配体与受体仅仅结合而不发生内移的情况下（细胞置于4℃条件下）,则只见acLDL可以激活MAPKs（p38, JNK, ERK）家族信号分子,而岩藻多糖却不能激活上述信号分子。因此,本研究在后续的内吞试验中只选用配体岩藻多糖,以避免配体与受体结合时可能激发的信号影响。使用SiRNA和化学阻断剂分别阻断特定的内吞路径后,再检测岩藻多糖对MAPKs（p38, JNK, ERK）信号分子激活的影响,结果表明,当阻断网格蛋白内吞路径后,岩藻多糖激活的ERK信号分子受到明显抑制,p38和JNK信号分子激活不受影响;当阻断小凹蛋白内吞路径后,岩藻多糖激活的p38和JNK信号分子会受到明显抑制,而ERK信号分子的激活不受影响。这就提示,SR-A网格蛋白内吞路径可能与ERK信号通路相耦联,而小凹蛋白内吞路径与p38和JNK信号通路相耦联。最后,我们想进一步明确SR-A耦联的下游信号通路和功能之间的关系。在研究中我们分别使用了p38、JNK和ERK三个信号分子的化学抑制剂（SB203580,SP600125,PD98059）来特异性地抑制这三个信号分子的激活,随后观察对SR-A依赖性的巨噬细胞凋亡的影响。实验观察发现,当p38和JNK激活受到抑制后,SR-A介导的巨噬细胞凋亡也明显受到抑制;而ERK信号抑制后则无此现象出现。因此,p38和JNK信号通路可能为SR-A依赖性的细胞凋亡所必需。总之,本课题研究结果显示,SR-A作为巨噬细胞表面的一类重要受体蛋白,同时具备网格蛋白依赖型和小凹蛋白依赖型两种内吞路径。其配体岩藻多糖经由小凹蛋白路径内吞时,通过激活下游的p38和JNK信号途径,进一步引起SR-A依赖性巨噬细胞凋亡。如果岩藻多糖通过网格蛋白路径内吞时,则激活下游ERK信号分子,其具体的生物学意义尚不明了。SR-A介导的脂质内吞主要通过网格蛋白内吞路径。上述研究结果从分子水平上解释了SR-A功能多样性的结构基础:由于存在不同的内吞方式,使得SR-A在与不同的配体甚至是同一种配体发生反应时,通过选择不同的内吞通路,表现出特定的生物学功能。由于SR-A在调控巨噬细胞多项重要功能的过程中发挥重要作用,因此对于SR-A内吞路径的阐明,有利于今后更加深入地认识SR-A选择性调控机制,并为相关重要疾病的诊治提供了新的靶点。