基于SPR技术的传感芯片的研制及其应用

论文摘要

基于表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）的生物传感器，能够实时监测生物分子间的相互作用，且无需标记，已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境监测等领域，并且显示出广阔的应用前景。传感芯片是Biacore系列仪器的核心部件，目前芯片只能从Biacore公司购买，价格昂贵，导致很多仪器利用率低下，资源处于闲置状态。此外，传感芯片的种类较为单一和物质在芯片表面的固定存在困难，也都不同程度地阻碍SPR生物传感器的应用推广。为降低芯片的成本，本论文对J1、C1、CM5、SA和NTA等常用SPR传感芯片的制备与再生方法进行了研究，并对相应的制备工艺进行了完善，通过本实验室大量实验验证以及国内多个科研单位试用，制备的芯片具有Biacore芯片同等品质，可以满足实验的要求；为了增加芯片类型的可选择性，本论文对一种具有与CM5芯片相同羧基表面的新型传感芯片——rBSA芯片进行了研制，制备方法耗时短、操作简易，且成本低廉，通过原子力显微镜表征rBSA芯片表面，以及应用rBSA芯片检测磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，SMX）的实验表明，制备的芯片具有均一的表面基质和优良的性能，能够满足实验的需要，完全可以用于环境中SMX的定量分析；为了提高NTA芯片的偶联性能，本研究对具有更高NTA分子密度的改进型NTA芯片进行了研制，制备方法快速、简便、高效，通过比较芯片改进前后对7种带6×His-tag重组蛋白的偶联效果，表明改进型NTA芯片具有优异的性能。另外，本论文应用自主制备的CM5芯片，模拟不锈钢冠状动脉血管支架表面，首次利用SPR技术分析了传感芯片金属表面不同分子量的壳聚糖对质粒DNA的保护作用，为研究载基因血管支架的基因结合稳定性和筛选更好的载体材料提供了新的方法和手段。之后，我们还首次提出并利用在线管内SPME-SPR联用技术，应用自主制备的CM5芯片对海水和血液中的雌二醇进行了定量分析。这种新方法不仅简单、快捷，而且，所有的操作步骤可以实现自动化，与离线技术相比，能避免或减少引入人为的误差。综上所述，本论文围绕SPR传感芯片，立足已有的研究基础，面向应用，研制出多种具有自主知识产权的SPR传感芯片，不仅大大降低了仪器的运行成本，而且在一定程度上提高了SPR生物传感器的检测分析能力，为SPR生物传感器的进一步应用推广以及国产SPR生物传感器的研发应用奠定了基础。此外，通过应用自主制备芯片进行多方面的分子相互作用分析和物质浓度检测，为SPR技术在新领域的应用提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 SPR生物传感器概述
• 1.1.1 SPR的基本原理
• 1.1.2 SPR技术的特点
• 1.1.3 SPR生物传感器的发展历程与现状
• 1.2 SPR 传感芯片
• 1.2.1 SPR传感芯片的结构特点
• 1.2.1.1 耦合器件
• 1.2.1.2 金属膜
• 1.2.1.3 表面基质
• 1.2.2 SPR传感芯片的类型
• 1.2.3 SPR传感芯片的制备
• 1.2.3.1 金属膜的制备
• 1.2.3.2 表面基质的构建
• 1.3 SPR生物传感器的常规分析方法
• 1.3.1 一步法和多步法
• 1.3.2 直接法和间接法
• 1.3.2.1 直接检测法
• 1.3.2.2 信号增强法
• 1.3.2.3 竞争抑制法
• 1.3.2.4 竞争结合法
• 1.4 SPR生物传感器的应用研究
• 1.4.1 核酸相互作用分析
• 1.4.2 细胞信号通路研究
• 1.4.3 酶分析
• 1.4.4 食品安全
• 1.4.5 环境监测
• 1.4.6 药物筛选
• 1.4.7 遗传学分析
• 1.5 SPR生物传感器的发展前景展望
• 1.6 本论文的研究工作
• 1.6.1 研究背景与意义
• 1.6.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 常用SPR传感芯片的研制及其应用
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 仪器与试剂
• 2.1.2 镀金基片的制备
• 2.1.3 表面基质的构建
• 2.1.3.1 J1芯片的制备
• 2.1.3.2 C1芯片的制备
• 2.1.3.3 CM5芯片的制备
• 2.1.3.4 SA芯片的制备
• 2.1.3.5 NTA芯片的制备
• 2.1.4 芯片的应用实例
• 2.1.4.1 J1芯片偶联SMX
• 2.1.4.2 C1芯片偶联SMX
• 2.1.4.3 CM5芯片偶联SMX
• 2.1.4.4 SA芯片测试转录因子GlnR与其结合序列间的相互作用
• 2+离子的稳定性测试'>2.1.4.5 NTA芯片结合Ni²⁺离子的稳定性测试
• 2.1.4.6 NTA芯片测试蛋白-DNA相互作用
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 J1、C1和CM5芯片偶联SMX效果的比较
• 2.2.2 SA芯片测试转录因子GlnR与调控序列的相互作用
• 2+离子的稳定性测试'>2.2.3 NTA芯片结合Ni²⁺离子的稳定性测试
• 2.2.4 NTA芯片测试蛋白-DNA相互作用
• 2.2.5 芯片再生次数
• 2.2.6 芯片正反面的鉴别
• 2.3 结论
• 参考文献
• 第三章 一种新型SPR传感芯片的制备及其应用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 rBSA芯片的制备
• 3.1.2.1 回收传感芯片的预处理
• 3.1.2.2 rBSA的制备
• 3.1.2.3 rBSA与nBSA芯片的制备
• 3.1.3 原子力显微镜法测定芯片表面修饰效果
• 3.1.4 rBSA芯片检测SMX
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 rBSA芯片的制备
• 3.2.2 AFM测定芯片表面修饰效果
• 3.2.3 rBSA芯片检测SMX
• 3.3 结论
• 参考文献
• 第四章 改进型NTA传感芯片的研制及其应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 仪器与试剂
• 4.1.2 改进型NTA芯片的制备
• 4.1.3 NTA芯片改进前后的性能测试
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 NTA芯片改进前后螯合金属离子的能力比较
• 4.2.2 NTA芯片改进前后的性能变化
• 4.3 结论
• 参考文献
• 第五章 SPR技术检测金属表面不同相对分子量壳聚糖对DNA的保护作用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 仪器与试剂
• 5.1.2 壳聚糖芯片的制备
• 5.1.3 DNase Ⅰ酶解试验
• 5.1.4 壳聚糖对质粒DNA的保护作用
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 DNase Ⅰ酶解试验
• 5.2.2 壳聚糖对质粒DNA的保护作用
• 5.3 结论
• 参考文献
• 第六章 在线管内SPME-SPR检测雌二醇的方法研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 仪器与试剂
• 6.1.2 样品收集与处理
• 6.1.3 雌二醇-3-羧甲基醚的制备
• 6.1.4 雌二醇抗原在CM5芯片上的固定
• 6.1.5 雌二醇的管内SPME-SPR分析
• 6.1.6 回收率实验
• 6.1.7 样品处理与管内SPME-SPR分析
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 雌二醇抗原在CM5芯片上的固定
• 6.2.2 雌二醇的管内SPME-SPR分析
• 6.2.3 回收率实验
• 6.2.4 样品处理与管内SPME-SPR分析
• 6.3 结论
• 参考文献
• 第七章 结语
• 7.1 主要研究成果
• 7.2 意义与创新性
• 7.3 建议与展望
• 附录1 质粒DNA的提取
• 附录2 在线管内SPME-SPR检测雌二醇的补充材料
• 附录3 缩略语表
• 论文及专利
• 致谢