精氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Arg）的相互作用

论文题目: 精氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Arg）的相互作用

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 李娟

导师: 王恩多

关键词: 嗜热脂肪芽胞杆菌,精氨酰,合成酶,特征序列,互补,个性元件

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS) 在第一类氨基酰-tRNA 合成酶(aaRS)中较为特殊,大多数不同来源的ArgRS 缺乏保守的KMSK 序列。而嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus) ArgRS 中却存在这一特征序列。在大肠杆菌(Escharichia coli) 中分别克隆和高表达了酶和tRNA 的基因,纯化了它们。在体外反应体系中,55℃时B. stearothermophilus ArgRS 精氨酰化B. stearothermophilus tRNAArg(ACG) 的反应速度常数kcat为17 s~-1,在37℃时该常数为6.6 s~-1。对不同来源的第一类aaRS 的序列列队比较和已知的三级结构分析,以及对B. stearothermophilus 和E. coli ArgRS 的定点突变进行研究,发现在HIGH 特征序列上游第三个氨基酸残基与KMSK 特征序列中的第二个赖氨酸残基( K )存在互补关系,指出在ArgRS 的序列中这两个位置的任何一处必须只有一个K 才具备进行精氨酸活化反应的结构基础。根据HIGH 序列上游的氨基酸残基和KMSK 序列的保守性可将不同来源的ArgRS 分为三类。研究了E. coli、B. stearothermophilus 和嗜热菌(T. thermophilus) ArgRS 与tRNAArg (ACG) 的交叉识别后,发现B. stearothermophilus ArgRS 虽能识别T. thermophilus tRNAArg(ACG) ,却不能有效识别同样具有A20 的E. coli tRNAArg(ACG)。在55℃时B. stearothermophilus ArgRS 精氨酰化E. coli

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章嗜热脂肪芽胞杆菌精氨酰-tRNA 合成酶的性质研究

摘要

关键词

引言

实验部分

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 B.stearothermophilus 基因组的抽提和PCR 扩增目的基因

1.2.2 含B.stearothermophilus ArgRS 基因质粒的构建

1.2.3 B.stearothermophilus ArgRS 基因的表达

1.2.4 B.stearothermophilus ArgRS 的纯化

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.2.6 蛋白质浓度的测定

1.2.7 园二色性(CD)光谱的测定

1.2.8 含 B.stearothermophilus tRNAArg(ACG) 基因表达质粒的构建

1.2.9 B.stearothermophilus tRNAArg(ACG) 基因的表达

1.2.10 总tRNA 的抽提

1.2.11 B.stearothermophilus tRNAArg(ACG) 的纯化

1.2.12 B.stearothermophilus ArgRS 精氨酰化反应的最适镁离子浓度和pH 值的测定

1.2.13 B.stearothermophilus ArgRS 精氨酰化反应最适温度的测定

1.2.14 B.stearothermophilus ArgRS 热稳定性实验

1.2.15 B.stearothermophilus ArgRS 动力学常数的测定

2. 实验结果

2.1 质粒pET28a(+)-argS’的构建

2.2 B.stearothermophilus ArgRS 的纯化

2.3 B.stearothermophilus ArgRS 的二级结构分析

2.4 B.stearothermophilus tRNAArg(ACG)基因表达质粒的构建和tRNAArg(ACG) 的纯化

2.5 B.stearothermophilus ArgRS 精氨酰化反应的最适镁离子浓度和pH 值

2.6 B.stearothermophilus ArgRS 精氨酰化反应活力与温度的关系

2.7 B.stearothermophilus ArgRS 催化动力学常数的测定

讨论

参考文献

第二章嗜热脂肪芽胞杆菌精氨酰-tRNA 合成酶的特征序列 KMSK 与其它氨基酸残基的作用

摘要

关键词

引言

实验部分

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 表达B. stearothermophilus ArgRS 突变酶基因的质粒构建所用的引物

1.2.2 含B.stearothermophilus ArgRS 突变酶基因质粒的构建

1.2.3 含E.coli Hi56-ArgRS 及其突变酶基因质粒的构建

1.2.4 B.stearothermophilus 和E. coli ArgRS 突变酶基因的表达以及突变酶的纯化

1.2.5 蛋白质浓度的测定

1.2.6 ArgRS 的精氨酸活化反应活力的测定

2. 实验结果

2.1 B.stearothermophilus ArgRS 突变酶基因的表达和酶的纯化

2.2 E.c oli ArgRS 突变酶基因的表达和酶的纯化

2.3 B.stearothermophilus ArgRS 突变酶精氨酸活化活力的测定

2.4 E.coli ArgRS 突变酶精氨酸活化活力的测定

讨论

参考文献

第三章精氨酰-tRNA 合成酶对tRNAArg(ACG)的识别的种属特异性研究

摘要

关键词

引言

实验部分

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1.T.thermophilus ArgRS 基因的克隆、表达和酶的纯化

1.2.2.T.thermophilus tRNAArg(ACG) 基因的克隆,表达和tRNAArg(ACG) 的纯化

1.2.3 含B.stearothermophilus tRNAArg(ACG) 基因的体外表达重组质粒的构建

1.2.4 含E.coli tRNAArg(ACG) 突变基因体外表达重组质粒的构建

1.2.5 体外转录模板DNA 的制备和体外转录

1.2.6 ArgRS 精氨酰化反应活力的测定

2. 实验结果

2.1 T.thermophilus ArgRS 和其tRNAArg(ACG) 的纯化

2.2 ArgRS 精氨酰化体内表达的tRNAArg(ACG) 的速度常数比较

2.3 ArgRS 精氨酰化体外转录的tRNAArg (in vitro) 和体内表达的tRNAArg (in vivo) 的速度常数比较

2.4 B.stearothermophilus ArgRS 对E. coli tRNAArg(ACG) 突变体的识别

讨论

参考文献

结论

附录:本论文缩写汇编

在学期间论文发表和获奖目录

致谢

发布时间: 2005-09-09

参考文献

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