阿非利加棉细菌人工染色体文库的构建

论文摘要

阿非利加棉（Gossypium herbaceum var. africanum）是二倍体两个栽培种（草棉G. herbaceum和亚洲棉G. arboreum）唯一的野生类型，是四倍体棉种A亚组的供体种，既有栽培棉的纤维产量，也有野生棉的抗逆、抗病虫等优良特性，其基因组信息对于挖掘抗生物、非生物逆境基因十分重要。但由于此材料稀少，目前对其基因组的研究报道很少。本研究基于已有的四倍体棉种BAC文库构建方法，以阿非利加棉为材料，通过对构建过程中的一些环节进行改进，首次成功构建了A亚组供体种阿非利加棉的BAC文库。在构建此文库的基础上，利用遗传图谱上一些与抗性基因紧密连锁的SSR分子标记，筛选BAC文库，取得的研究结果如下：1.本研究分别用阿非利加棉暗培养幼苗子叶以及暗培养处理的毛棉成株叶片为材料，按照Ma等的方法，比较这两种不同叶片对高分子量DNA的制备效果，结果表明：利用暗培养幼苗子叶制备的胶块较为透明，说明用子叶提取的高分子量DNA较为纯净，几乎没有酚类等杂质的污染；利用暗培养处理的成株叶片制备的胶块颜色发褐，说明成株叶片提取的高分子量DNA有酚类物质的氧化。然而这两种颜色的胶块经脉冲场凝胶电泳分析结果表明：两种胶块所获得的DNA主带明显，大小一致，后期的研究表明，所得到的核DNA均能够被限制性内切酶消化，转化效率较高，检测插入片段也能满足实验所需，说明酚类物质的氧化对构建棉花BAC文库几乎无影响。2.本研究以阿非利加棉为材料，以pIndigoBAC-5（Hind III-Cloning Ready）为载体，构建了阿非利加棉的BAC文库。该文库一共包含75000个克隆，覆盖该棉种全基因组（1667Mb）的5倍左右。插入片段大多数集中在100-150kb，其中100-120kb的克隆占40%，120-150kb的克隆占26.2%，70%的克隆大于或等于100kb，平均插入片段为115kb，空载率小于4%。从文库中找到任意单拷贝序列或筛选到某个基因的概率为99.3%，高于国际通用标准（90%），意味着所构建的BAC文库能符合筛选基因的需要。该文库的构建为目的基因的定位、基因的图位克隆、开展棉属A基因组与其他基因组比较研究以及进行棉种进化和分类提供了重要的基因组资源。3.在BAC文库构建过程中，对第一次选择这一环节进行了改进，即将第一次选择的起始脉冲时间进行了调整，将之前实验过程中使用的起始脉冲时间50s改为了10s，结果回收到了以前实验过程中期望得到，但是一直没有得到的100-200kb范围内的DNA片段，回收到的片段很集中，大大提高了转化效率。4.为了验证该文库对棉花基因组的覆盖情况及利用价值，在构建BAC文库的基础上，以每块384板保存的单克隆混合后为一个一级混合池，共构建了40个一级混合池。用位于A1-a05、A1-a07、A1-a08、A1-a09、A1-a11这几条A染色体组上，与抗黄萎病QTL紧密连锁的9对SSR引物筛选40个BAC一级混合池。每条染色体上都筛到了一些阳性克隆，克隆数介于1-14个之间，这些抗黄萎病相关基因阳性克隆的获得为进一步发掘分子标记、分离抗黄萎病重要性状基因、及其相应调控元件奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 野生棉资源
• 1.2 细菌人工染色体的发展
• 1.3 细菌人工染色体的优点
• 1.4 细菌人工染色体文库的应用
• 1.4.1 基因组测序
• 1.4.2 基因组物理图谱构建
• 1.4.3 基因的图位克隆
• 1.4.5 转基因技术
• 1.4.6 BAC 与 FISH 相结合的应用
• 1.5 BAC 文库研究进展
• 1.6 BAC 文库的筛选
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器设备与易耗品
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 材料
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 黄化苗的培养
• 2.3.2 高分子量基因组 DNA 的提取
• 2.3.3 胶块质量的检测
• 2.3.4 非目的片段的去除
• 2.3.5 部分酶切最佳酶量的确定
• 2.3.6 大片段 DNA 的大量酶切
• 2.3.7 高分子量 DNA 酶切片段的第一次选择
• 2.3.8 高分子量 DNA 酶切片段的第二次选择
• 2.3.9 酶切片段的回收
• 2.3.10 DNA 浓度的检测
• 2.3.11 大片段 DNA 与载体的连接
• 2.3.12 连接产物的转化
• 2.3.13 BAC 克隆的分析
• 2.3.14 BAC 文库的保存和复制
• 2.3.15 单克隆文库一级池的构建
• 2.3.16 BAC 文库一级池的筛选
• 2.3.17 PCR 扩增产物检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 胶块的制备
• 3.2 DNA 质量检测
• 3.3 细胞核 DNA 的部分酶切及最适酶量的确定
• 3.4 大片段 DNA 的两次选择
• 3.5 二次选择后大片段浓度的估测
• 3.6 大片段 DNA 和载体的连接及转化
• 3.7 BAC 文库插入片段检测
• 3.8 基于抗黄萎病 SSR 标记的 BAC 文库筛选
• 第四章 讨论
• 4.1 高分子量基因组 DNA 的提取
• 4.2 部分酶切条件的确定
• 4.3 酶切片段的两次选择
• 4.4 大片段 DNA 的回收和连接
• 4.5 大片段 DNA 的电击转化效率
• 4.6 BAC 克隆的保存
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录:主要试剂配方
• 致谢
• 作者简历