论文题目: 绿豆生物活性物质的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 分析化学
作者: 汪少芸
导师: 饶平凡,叶秀云
关键词: 绿豆,苹果酸脱氢酶,几丁质酶,非特异性脂转移蛋白,溶菌酶,抑菌,结晶
文献来源: 福州大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文是关于绿豆中生物活性物质的分离纯化、表征、蛋白质晶体培养、X-衍射及其结构与功能关系的研究。利用硫酸铵沉降、弱阳离子色谱CM-Sephadex C-50、POROS 20HS高效液相强阳离子交换色谱和Sephadex-G75凝胶色谱等方法从绿豆中分离纯化出包括苹果酸脱氢酶、几丁质酶、溶菌酶和非特异性脂转移蛋白等四个生物活性物质。并经SDS-PAGE、ClC反向色谱、质谱及N-端氨基酸测序鉴定了各活性物质的纯度。苹果酸脱氢酶由SDS-PAGE 鉴定为单倍体蛋白,分子量为38.0 kDa,等电点为9.7。最适pH 为7.2,最适温度为35℃,Km为112μM。N-末端序列为N-ASEPGPERKVAVLGAAGGIG-20,与其它植物来源的MDHs 的同源性75%～95%不等。K+对酶有激活作用,Ca2+和Mg2+对酶活影响不大,Zn2+, Pb2+和Cu2+抑制酶活作用,Zn2+的抑制类型为非竞争性抑制。几丁质酶由SDS-PAGE 鉴定是单倍体蛋白,分子量为30.8 kDa,等电点为6.3。最适pH 值为5.4,最适反应温度为40～50℃。对菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、花生褐斑病菌和水稻白绢病菌表现出抑菌活性。溶菌酶是分子内存在二硫键的单倍体蛋白,分子量为14.4kDa。N-末端序列为N-DMPGKVALTAQSF-13,与鸡蛋清溶菌酶（HEWL）同源性为23%。最适pH 值为5.5,最适反应温度为55℃。对菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白绢病菌、立枯丝核菌和葡萄灰霉病菌六种真菌和金黄色葡萄球菌具有很明显的抑菌活性。对菜豆根腐病菌的IC50 值为11μM,对金黄色葡萄球菌的MIC 值为0.26μM。非特异性脂转移蛋白nsLTP 是分子内存在二硫键的单倍体蛋白,分子量为9292Da;具有脂结合活性;对真菌菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白绢病菌和金黄色葡萄球菌表现出抑制作用,对金黄色葡萄球菌的MIC 值为0.06 mmol/ml;N-端序列为N-MTCGQVQGNLAQCIGFLEKGG-21,与其他植物来源的同种蛋白具有较高的相似性。根据Crystal Screen 配制结晶缓冲液筛选结晶条件,确定以硫酸铵为沉淀剂,辛基-β-D-喃葡萄糖为去污剂,0.1mol/L Tris-HCl,pH8.5 的条件下晶体生长。在297K,约7天时间长出尺寸0.3×0.15×0.15mm的单晶。该晶体属于斜方晶形,晶胞参数为a =38.671, b = 51.785, c = 55.925A|°,α=β=γ=90℃,空间群为P212121, 分辩率达2.4A|°。假定一个不对称单位含一个分子,Z = 4,则VM值约3.0A|°3Da-1,水溶液含量约58%。非特异性脂转移蛋白nsLTP 的结构存在着由4 个α-螺旋通过柔性环连接所形成的一个相对紧密的可以结合油脂的内陷的疏水空腔,该结构由8 个高度保守的半胱氨酸残基所组成4 个二硫键所稳定。NsLTP 抑菌机制的重要分子基础是具有脂结合活性、分子结构中存在一个由4 个α螺旋组成的疏水空腔结构和α螺旋具有两亲性。
论文目录:
第1章 综述
1.1 绿豆生物活性物质及生理功能
1.1.1 绿豆
1.1.2 绿豆组成
1.1.3 绿豆生物活性物质
1.1.4 绿豆生理功能
1.2 植物抗菌蛋白(肽)
1.2.1 植物抗菌蛋白(肽)的研究意义
1.2.2 植物抗菌蛋白(肽)的种类
1.2.2.1 植物抗菌蛋白
1.2.2.2 植物抗菌肽
1.2.3 植物抗菌蛋白(肽)抑菌机理
1.2.4 植物抗菌蛋白(肽)实际应用
1.3 豆科植物中生物活性物质的研究进展
1.3.1 苹果酸脱氢酶的研究进展
1.3.1.1 苹果酸脱氢酶的催化活性和生理作用
1.3.1.2 苹果酸脱氢酶的研究进展
1.3.2 几丁质酶的研究进展
1.3.2.1 几丁质酶的酶学性质
1.3.2.2 几丁质酶的生物活性
1.3.2.3 几丁质酶基因的转化
1.3.3 溶菌酶的研究进展
1.3.3.1 溶菌酶的性质及生理功能
1.3.3.2 溶菌酶的研究与应用
1.3.4 植物脂转移蛋白的研究进展
1.3.4.1 植物脂转移蛋白的生物性质
1.3.4.2 植物脂转移蛋白的结构研究
1.4 豆科植物生物活性蛋白的研究方法
1.4.1 蛋白质的分离纯化
1.4.2 蛋白质的生物活性表征
1.4.3 蛋白质的结晶
1.5 本研究的意义与目的
1.5.1 绿豆研究的新思路
1.5.2 本研究的意义与目的
第2章 材料与方法
2.1 绿豆生物活性物质的分离纯化
2.1.1 绿豆汁的硫酸铵沉降
2.1.1.1 盐析原理
2.1.1.2 材料与仪器
2.1.1.3 实验步骤
2.1.2 离子交换色谱法(IEC)
2.1.2.1 原理
2.1.2.2 常压色谱
2.1.2.3 高效离子交换液相色谱
2.1.3 凝胶过滤色谱法(SEC)
2.1.3.1 原理
2.1.3.2 材料与仪器
2.1.3.3 实验流程
2.2 绿豆生物活性物质组分分分析方法
2.2.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2.1.1 原理
2.2.1.2 材料与仪器
2.2.1.3 溶液配制
2.2.1.4 实验流程
2.2.2 毛细管液相色谱(CLC)
2.2.2.1 原理
2.2.2.2 材料与仪器
2.2.2.3 色谱条件
2.2.3 蛋白质含量测定
2.2.3.1 原理
2.2.3.2 材料与仪器
2.2.3.3 实验步骤
2.2.4 N-末端序列测定及序列分析
2.2.4.1 原理
2.2.4.2 材料与仪器
2.2.4.3 N-末端序列测定
2.2.4.4 序列分析
2.2.5 基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间质谱分析
2.2.5.1 MALDI-TOF 技术原理
2.2.5.2 材料与仪器
2.2.5.3 质谱分析
2.3 绿豆生物活性物质的分子量标定
2.4 绿豆生物活性物质的等电点测定
2.4.1 等电聚焦凝胶电泳法原理
2.4.2 等电点测定
2.5 绿豆生物活性物质的酶学表征
2.5.1 苹果酸脱氢酶的酶学性质
2.5.1.1 酶活力的测定
2.5.1.2 最适反应pH 的测定
2.5.1.3 最适反应温度的测定
2.5.1.4 热稳定性实验
2.5.1.5 米氏常数(Km)的测定
2.5.1.6 金属离子对酶活力的影响
2.5.2 几丁质酶的酶学性质
2.5.2.1 酶活力的测定
2.5.2.2 最适反应pH 的测定
2.5.2.3 最适反应温度的测定
2.5.2.4 热稳定性实验
2.5.3 溶菌酶的酶学性质
2.5.3.1 酶活力的测定
2.5.3.2 最适反应pH 的测定
2.5.3.3 最适反应温度的测定
2.5.3.4 热稳定性实验
2.6 绿豆生物活性物质的抑菌活性测定
2.6.1 原理
2.6.2 材料与仪器
2.6.2.1 受试菌种
2.6.2.2 仪器设备
2.6.3 抗真菌活性实验
2.6.3.1 抑菌圈法活性测试
2.6.3.2 抑菌IC50 测试
2.6.3.3 真菌形态的观测
2.6.4 抗细菌活性实验
2.6.4.1 抗细菌活性测定
2.6.4.2 细菌形态的观测
2.6.4.3 抑菌强度的测试
2.7 绿豆脂转移蛋白脂结合活性的测定
2.7.1 原理
2.7.2 材料与仪器
2.7.3 实验步骤
2.8 绿豆脂转移蛋白质的晶体培养
2.8.1 蛋白质晶体培养原理
2.8.2 蛋白质晶体培养过程及要求
2.8.3 材料与仪器
2.8.4 实验步骤
2.9 绿豆脂转移蛋白质晶体的X-衍射
2.9.1 X-衍射方法原理
2.9.2 材料与仪器
2.10 绿豆脂转移蛋白质的结构分析
2.10.1 结构解析原理
2.10.2 结构解析
2.11 本课题的实验流程
第3章 结果与讨论
3.1 绿豆生物活性物质的分离
3.1.1 绿豆汁的初步分离——硫酸铵沉淀
3.1.2 CM-Sephadex 色谱纯化及活性检测
3.2 绿豆苹果酸脱氢酶的纯化及表征
3.2.1 P1 组分的高效液相色谱纯化
3.2.2 纯度鉴定和分子量标定
3.2.3 等电点测定
3.2.4 苹果酸脱氢酶的酶学性质
3.2.4.1 苹果酸脱氢酶的酶活
3.2.4.2 pH 对苹果酸脱氢酶酶活的影响
3.2.4.3 温度对苹果酸脱氢酶酶活的影响
3.2.4.4 苹果酸脱氢酶的热稳定性
3.2.4.5 米氏常数的测定
3.2.4.6 金属离子对酶活力的影响
3.2.5 N-末端序列测定与分析
3.2.6 苹果酸脱氢酶的酶学性质比较及意义
3.3 绿豆几丁质酶的纯化及表征
3.3.1 P1 组分的高效液相色谱纯化
3.3.2 P0’组分的凝胶色谱进一步纯化
3.3.3 纯度鉴定和分子量标定
3.3.3.1 SDS-PAGE 电泳分析
3.3.3.2 毛细管液相色谱法(CLC)
3.3.4 等电点测定
3.3.5 几丁质酶的酶学性质
3.3.5.1 几丁质酶的酶活
3.3.5.2 pH 对几丁质酶活的影响
3.3.5.3 温度对几丁质酶活的影响
3.3.5.4 几丁质酶的热稳定性
3.3.6 几丁质酶抗真菌活性
3.3.6.1 抗真菌测试
3.3.6.2 抗菌形态观测分析
3.3.7 豆科植物几丁质酶的性质比较
3.4 绿豆溶菌酶的纯化及表征
3.4.1 P2 组分的水浴除杂蛋白
3.4.2 P2 组分的高效液相色谱纯化
3.4.3 纯度鉴定和分子量标定
3.4.3.1 SDS-PAGE 电泳分析
3.4.3.2 毛细管液相色谱法(CLC)
3.4.4 N-末端序列测定与分析
3.4.5 溶菌酶的酶学性质
3.4.5.1 溶菌酶的酶活
3.4.5.2 pH 对溶菌酶酶活的影响
3.4.5.3 温度对溶菌酶酶活的影响
3.4.5.3 溶菌酶的热稳定性
3.4.5.4 溶菌酶的的酶学性质比较
3.4.6 溶菌酶抗真菌活性
3.4.6.1 抗真菌测试
3.4.6.2 抗真菌形态观测分析
3.4.7 溶菌酶抗细菌活性
3.4.8 绿豆溶菌酶的新特性
3.5 绿豆非特异脂转移蛋白(NSLTP)的纯化及表征
3.5.1 P1 组分的高效液相色谱纯化
3.5.2 纯度鉴定和分子量标定
3.5.2.1 SDS-PAGE 电泳分析
3.5.2.2 MALDI-TOF 质谱鉴定
3.5.3 nsLTP 的N-末端序列测定与分析
3.5.4 nsLTP 抗真菌活性
3.5.5 nsLTP 抗细菌活性
3.5.6 nsLTP 的脂结合活性
3.5.7 nsLTP 抗菌形态观测分析
3.6 绿豆非特异脂转移蛋白的晶体培养与结构分析
3.6.1 结晶条件的筛选
3.6.1.1 结晶温度的选择
3.6.1.2 结晶缓冲液的初选择
3.6.1.3 结晶缓冲液的再选择
3.6.1.4 结晶缓冲液的优化
3.6.2 nsLTP 晶体的X-衍射
3.6.3 nsLTP 的结构分析
3.6.4 nsLTP 的结构与功能的关系
3.6.4.1 nsLTP 的结构与脂转移活性
3.6.4.2 nsLTP 的结构与抗菌活性
3.7 绿豆功能蛋白质组
3.7.1 绿豆功能蛋白质组的特性分析
3.7.2 绿豆功能蛋白质组的抗菌机理
3.7.2.1 抗真菌机理分析
3.7.2.2 抗细菌机理分析
3.8 植物防御蛋白
3.8.1 植物防御蛋白的色谱行为
3.8.2 植物防御蛋白的生物多样性
3.9 生物界功能分子的进化趋向
第4章 总结与展望
4.1 总结
4.2 展望
参考文献
附录
致谢
个人简历
攻读博士学位期间的学术论文及学术活动
发布时间: 2005-10-10
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