NF-κB信号通路介导HBx蛋白引起的肝癌细胞多药耐药

NF-κB信号通路介导HBx蛋白引起的肝癌细胞多药耐药

论文摘要

研究目的:研究HBx蛋白引起肝癌细胞多药耐药的分子机制,并探讨NF-κB信号通路在该过程中的作用。研究方法:构建HBx表达载体并转染HepG2细胞,筛选得到稳转细胞株HepG2-HBx。化疗药物处理转染前后的细胞,利用MTT实验分析药物对细胞的生长抑制率,并通过AnnexinV/PI流式凋亡实验检测细胞的凋亡率。采用相对定量实时荧光PCR (SQ-real time-PCR)和Western blot方法分别检测HBx转染前后肝癌细胞中多药耐药(MDR)相关基因的mRNA和蛋白水平的表达差异。通过免疫荧光染色法检测p65在细胞中的定位,进而分析转染细胞中NF-κB信号通路的活化状态。NF-κB信号通路的特异性阻断剂IMD-0354阻断NF-κB通路后,再用SQ-real time-PCR法分析肝癌细胞中抗凋亡基因Gadd45β和Survivin的表达差异。研究结果:我们的研究发现肝癌细胞中HBx的表达能提高其对多种化疗药物(如5-氟尿嘧啶、阿霉素和氨萘非特)的耐受性。药物处理后,HepG2-HBx和HepG2.2.15细胞的凋亡率分别要明显低于HepG2-3.1和HepG2细胞(P<0.05)。与对照(HepG2-3.1)相比,HBx转染的肝癌细胞表达较高水平的MDR相关基因和抗凋亡基因Gadd45β、Survivin。另外,我们还发现HepG2-HBx的细胞核中能检测到一定水平的p65(而HepG2-3.1的细胞核中则基本检测不到),提示HBx转染激活了肝癌细胞中的NF-κB信号通路;而阻断NF-κB通路后,HBx表达株中抗凋亡基因的表达又显著下调,提示NF-κB通路参与了HBx引起的肝癌细胞抗凋亡基因的表达上调。研究结论:HBx蛋白是引起肝癌细胞多药耐药的重要因素之一,它很可能是通过激活NF-κB信号通路,进而上调MDR相关基因以及抗凋亡基因的表达而降低HBx表达株对多种化疗药物的敏感性。

论文目录

  • 致谢
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 目次
  • 1 引言
  • 1.1 研究背景
  • 1.2 研究目的
  • 1.3 研究步骤
  • 2 仪器材料
  • 2.1 实验仪器
  • 2.2 材料
  • 3 方法
  • 3.1 细胞培养
  • 3.2 质粒构建及转染
  • 3.3 RT-PCR检测
  • 3.4 MTT IC50测定
  • 3.5 AnnexinV/PI流式凋亡检测
  • 3.6 肿瘤耐药相关基因和抗凋亡基因检测
  • 3.7 Western blotting检测耐药相关蛋白
  • 3.8 免疫荧光染色及共聚焦荧光显微镜检测NF-κB p65在胞内的定位
  • 3.9 统计
  • 4 结果
  • 4.1 HepG2.2.15细胞对多种化疗药物的敏感性低于HPeG2细胞
  • 4.2 稳转HBx的HePGZ细胞株的构建
  • 4.3 转染HBx后的HepGZ细胞对化疗药物的敏感性明显降低
  • 4.4 HBx引起肝癌细胞MDR表型
  • 4.5 HBx引起NF一KB信号通路活化
  • 4.6 HBx通过NF一KB通路上调抗凋亡基因的表达
  • 5 讨论
  • 参考文献
  • 综述
  • References
  • 作者简历及在学期间所取得的科研成果
  • 相关论文文献

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