黄芪总苷对β-淀粉样蛋白和糖皮质激素协同诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机理的研究

论文摘要

背景中枢神经系统退行性疾病（ Progressive neurodegenerative disease）是一类发生在老年前期及老年期的慢性进行性中枢神经系统退行性疾病,严重威胁老龄人身体健康及生活质量,其中以阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）较为常见。AD又常被称为老年性痴呆,在临床上,AD患者的症状是以进行性的记忆减退、认知障碍、人格改变等为主要特征的综合症, WHO的调查报告结果表明,65岁以上老人的AD发病率约为5～20%,AD患者的平均存活时间只有5年;脑衰老是多层次,多重性的退行性变化,其病因尚未阐明,国内外也尚无良药来防治该类疾病。因而,研究AD的发病机理及防治方法受到社会的极大关注,也是目前神经药理学等研究的热点之一。AD的主要病理学特征是在中枢神经系统的皮层、海马等处产生大量的β-淀粉样蛋白（β-Amyloid protein, Aβ）,形成Aβ沉积、老年斑（Senile plaque, SP）和神经纤维缠结（Neurofibrilary tangle, NFT）,其中Aβ是构成老年斑的主要成份。Aβ是由β-淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）经β、r-secretase酶裂解生成,Aβ是构成老年斑的主要成份;Aβ在AD患者的神经元中过度生成及其对神经元的细胞毒作用,在AD的发病和进展过程中起关键的作用。糖皮质激素（Glucocorticoids, GCs）是调节机体生长发育、新陈代谢和维持机体功能正常的一类重要激素,也是临床常用的抢救和治疗药物,GCs具有多种生理和药理作用,但长期大剂量应用GCs可对机体免疫和神经等系统造成严重的不良反应。目前,国内外都注重研究Aβ、GCs分别与AD发病之间的关系,但将Aβ与GCs相关联,研究它们之间的相互促进海马神经元细胞毒作用却很少,仅检索到2篇相关论文。近年来,国内外都投入了大量人力、物力从事防治中枢神经系统退行性疾病、AD等疾病及其发病机制的研究工作,我国中医中药具有悠久的防治衰老的历史和丰富的临床实践经验,目前,在国内,一些研究单位着重研究了传统延缓衰老的常用中药及其复方的疗效和部分作用机理,取得了一定的进展,但都还基本处于临床前研究阶段,已批准上市的防治AD中药还寥寥无几。黄芪是临床延缓衰老的名药,黄芪总苷（Astragalosides, AST）是从黄芪中提取的有效部位群,我们的前期研究表明, AST不仅具有抗炎、免疫调节和防治局灶性脑缺血和全脑缺血再灌注引起的脑损伤作用,还能明显改善D-半乳糖衰老小鼠和地塞米松（Dexamethasone, DEX）引起的老前期（20 mon）衰老模型小鼠的学习记忆功能,改善环磷酰胺降低的小鼠学习记忆功能;但AST对Aβ和GCs引起的海马神经元损伤是否有保护作用还未见报道。由于Aβ和GCs分别在AD的发病中均起重要的作用,如Aβ可引起体外培养的海马神经元凋亡和活力下降,向大鼠海马CA1区注射Aβ可引大鼠学习记忆能力下降;小鼠在长期给予GCs时,在引起老前期小鼠海马神经元损伤的同时,还可引起学习记忆能力明显下降,但它们二者之间对神经元是否具有协同的细胞毒性作用仍然不清楚;此外,临床上仍无理想的防治AD的药物和方法。为进一步研究AD的发病机理和寻找有效的防治AD等神经系统退行性疾病的方法和药物,本文拟（1）在体内,研究DEX是否具有协同促进Aβ引起大鼠海马神经元损伤和学习记忆能力下降的作用,然后进一步研究其可能的作用机制。在体外,同样观察DEX协同促进Aβ引起海马神经元损伤,分析其可能的作用机理。（2）进一步探讨AST对A?和DEX诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用以及可能的相关分子与基因水平的作用机制。方法:第一部分地塞米松协同促进Aβ对大鼠海马神经元毒性及其机理的研究在体内,利用Morris水迷宫和病理组织检查,研究DEX（1 mg/kg/d,sc×7 d）和Aβ（海马CA1区注射、5μg/侧、双侧、单次）联合作用对大鼠学习记忆能力和海马神经元损伤的影响。在体外,取孕第18天Sprague Dawley（SD）大鼠胚胎的海马神经元进行体外原代培养,用MTT（Methyl thiazolyl tetrazolium）方法观察DEX（0.01-10μM）和Aβ25-35（1-40μM）对海马神经元活力的影响,分别找出DEX和Aβ引起海马神经元损伤的亚适浓度;再用MTT和TUNEL（Terminal- Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling）染色法检测DEX（1, 10μM）联合Aβ（1, 5μM）对海马神经元活力和神经元凋亡的影响,同时用激光共聚焦荧光显微镜测定DEX（10μM）联合Aβ25-35（5μM）对海马神经元胞内钙浓度（intracellular calcium, [Ca2+]i）的影响,用western blot分析测定核NF-κB（Nuclear Factor kappa B）、p53和p-tau蛋白含量,进一步探讨DEX是否通过下调核NF-κB蛋白水平,上调p53和p-tau蛋白水平促进Aβ的神经元毒性。第二部分黄芪总苷对A?和DEX协同诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机理的研究采用在大鼠海马CA1区注射A?25-35的方法,建立大鼠AD模型;运用Morris水迷宫方法观察AST对AD模型大鼠学习、记忆能力的影响;利用病理组织学检查,观察AST对AD模型大鼠脑组织病理性损伤的保护作用。在体外,培养胎鼠海马神经元的基础上,观察AST对A?和DEX+A?协同诱导海马神经元损伤的保护作用。采用MTT细胞活力检测法检测海马神经元细胞活力;利用TUNEL法检测细胞凋亡;运用激光共聚焦显微镜（Laser confocal microscopy ,LSCM）检测胞内钙离子浓度变化;用western blot分析测定p-tau蛋白含量;采用RT-PCR法检测P53 mRNA的表达;采用氯化硝基四唑氮蓝（Nitrotetrazolium blue chloride, NBT）法和苯甲酸羟化法观察AST对体外产生氧自由基是否有直接捕获作用。结果:第一部分地塞米松协同促进Aβ对大鼠海马神经元毒性及其机理的研究1. DEX（ 5 mg/kg/d, sc×7 d）或向大鼠双侧海马CA1区注射Aβ25-35（5μg/侧）可使大鼠逃避潜伏期和游泳距离有延长趋势,但无统计学意义;DEX（ 1 mg/kg/d, sc×7 d）对大鼠逃避潜伏期和游泳距离无明显影响;DEX和Aβ25-35联合使用后d9,大鼠逃避潜伏期及游泳距离明显延长,并有部分动物死亡（1/8-3/8）。病理组织学检验结果显示, 5 mg/kg/d DEX+ 5μg Aβ25-35组CA1区神经元数目明显减少,排列紊乱,脱失现象明显,核固缩为三角形或多角形,浓染。表明DEX可协同促进Aβ引起大鼠学习记忆能力下降和海马组织病理损伤的作用。2. DEX（0.01-10μM）对海马神经元细胞活力无明显影响;但A ?25-3（51-40μM）可浓度依赖性地降低海马神经元细胞活力;DEX（1μM, 10μM）预处理海马神经元24 h可明显增强Aβ25-35（1μM, 5μM）引起的海马神经毒性,显著降低海马神经元活力,说明DEX可协同促进A ?引起海马神经元损伤。3. DEX（1μM, 10μM）不能增加TUNEL染色阳性细胞数（对照组28.3%, DEX30.4%）,但DEX（10μM）预处理海马神经元24 h可明显增加Aβ（5μM）诱导的升高的海马神经元凋亡细胞数,表明DEX可协同促进Aβ引起海马神经元凋亡。4. Aβ25-35（5μM）组彗星拖尾长度明显大于溶剂对照组, DEX（10μM）对彗星拖尾长度无明显影响,但DEX（10μM）可进一步促进Aβ25-35（5μM）引起彗星拖尾长度增长,表明DEX可协同促进Aβ引起海马神经元DNA损伤,进一步证实DEX可协同促进Aβ引起海马神经元凋亡。5. Aβ25-35（5μM）作用海马神经元10 min后,海马神经元胞内[Ca2+]i轻度增加,维持60 min,然后逐渐下降; DEX（10μM）加入培养液中24 h后不能影响海马神经元的[Ca2+]i水平;但DEX（10μM）预处理海马神经元24 h后可进一步提高Aβ25-35（5μM）诱导的[Ca2+]i上升,使海马神经元胞内[Ca2+]i达到较高水平,说明DEX可能通过促进海马神经元胞内钙离子超载促进Aβ引起海马神经元损伤。6.与对照组（0μM Aβ, 0μM DEX）相比,10μM DEX不能增加海马神经元p53蛋白水平,5μM Aβ25-35组的p53蛋白量明显增加。DEX（10μM）+Aβ25-35（5μM）的p53蛋白表达量与同剂量Aβ25-35组相比,差异没有显著性。7. 5μM Aβ可时间依赖性地引起海马神经元核NF-κB蛋白表达量增加,与正常对照组相比,10μM DEX可使神经元核NF-κB表达量减少,5μM Aβ25-35能够增加核NF-κB表达量,与同剂量的Aβ（5μM）相比,DEX（10μM ）+Aβ25-35（5μM）组的核NF-κB表达量明显下降,说明DEX可能通过抑制海马神经元核NF-κB p65蛋白表达促进Aβ引起海马神经元损伤。此外,与对照组相比,5μM Aβ25-35作用海马神经元4 h后,胞浆IκBα表达量降低,10μM DEX组的胞浆IκBα表达量增加,DEX（10μM）可上调Aβ（5μM）引起的下降的胞浆IκBα表达量,提示DEX可能通过上调海马神经元胞质IκBα蛋白表达、抑制NF-κB p65核转移。8. Aβ25-35（0-20μM）能够呈剂量依赖性的增加海马神经元p-tau-Thr231蛋白水平,与对照组相比,10μM DEX亦能增加海马神经元p-tau-Thr231的蛋白水平。10μM DEX+5μM Aβ25-35组p-tau-thr231蛋白水平与同剂量DEX和Aβ25-35组相比,可进一步增加p-tau-thr231蛋白水平,提示DEX可能通过促进Aβ25-35引起p-tau-Thr231蛋白表达量增加而促进海马神经元损伤。第二部分黄芪总苷对A?和DEX协同诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机理的研究1.向大鼠海马CA1区注射A?25-35（10μg/侧,双侧）可制造大鼠AD模型,损伤大鼠的学习记忆能力;AST（20、40、80 mg/kg,ig×7 d）可引起AD模型大鼠升高的逃避潜伏期降低、游泳距离缩短,学习记忆能力恢复,表明AST对A?25-35引起大鼠的学习记忆能力损伤有保护作用。2.在海马CA1区注射A?25-35组,海马CA1区神经元数目明显减少,排列紊乱,脱失现象明显,部分神经元核消失。AST（40、80mg/kg）能不同程度改善上述神经元损伤,使海马神经元数目明显增加,排列较整齐,核消失现象改善。3.体外A?25-35（10-40μM）可直接引起海马神经元活力下降。AST（10、20和40μg/ml）对体外A?25-35（10-40μM）和DEX（10μM）+A?25-35（5μM）引起胎鼠海马神经元活力有保护作用,使MTT法A值分别上升3.6-125%和12.3%,表明AST对体外A?25-35和DEX+A?25-35引起的胎鼠海马神经元的损伤有保护作用。4. A?25-35（10μM）可引起海马神经元发生凋亡。AST（20μg/ml）能显著降低神经元中凋亡细胞的百分率; AST（20μg/ml）亦能明显降低DEX（10μM）+A?25-35（5μM）引起的增高的凋亡细胞百分率。5. A?25-35（10μM）可诱导海马神经元胞内[Ca2+]i升高;AST（20μg/ml）能使升高的胞内[Ca2+]i降低。AST（20μg/ml）亦能明显降低DEX（10μM）+A?25-35（5μM）引起的增高的海马神经元胞内[Ca2+]i。6. Aβ25-35（10μM）作用海马神经元1 h后,海马神经元p-tau-Thr231表达量显著升高;AST（10 , 20μg/ml）可显著下调Aβ引起的升高的p-tau-Thr231表达量。AST （10, 20μg/ml）亦能明显降低DEX（10μM）+A?25-35（5μM）引起的增高的海马神经元p-tau-Thr231蛋白表达水平。7. A?25-35（5μM）可诱导海马神经元p53 mRNA水平升高。加入AST （20μg/ml） 18小时后行RT-PCR,电泳结果显示p53 mRNA条带面积及灰度均降低,积分光密度下降。表明AST可以降低A?25-35诱导增加的海马神经元p53 mRNA水平。8. AST（5-80μg/ml）可浓度依赖性地抑制黄嘌呤（Xanthine, X）-黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase, XO）体系和非酶体系引起NBT还原显色反应; AST仅在高浓度（80μg/ml以上）时才对XO活性有抑制作用。AST（0.5-80μg/ml）与甘露醇（·OH捕捉剂）均可浓度依赖性地抑制Fenton反应引起的苯甲酸羟化。结论:（1）在体内,DEX具有促进Aβ引起大鼠学习记忆能力下降的作用,导致大鼠海马CA1区神经元数目明显减少、排列紊乱、脱失、浓染和核固缩。表明DEX与Aβ具有协同引起大鼠学习记忆下降和海马组织病理损伤的作用。（2）AST可逆转A?25-35引起的大鼠学习记忆下降和海马组织病理损伤。（3）在体外,DEX可明显促进Aβ引起海马神经元活性下降和细胞凋亡率增加,这可能与其具有协同促进Aβ引起海马神经元胞内Ca2+升高、下调升高的核NF-κB蛋白水平,引起tau高度磷酸化有关。另外,DEX对Aβ引起的升高的海马神经元总p53蛋白水平和核p53蛋白水平无影响。（4）在体外,AST对A?25-35、DEX+A?25-35引起的海马神经元损伤有保护作用, AST能明显降低A?和DEX+A?引起的升高的凋亡细胞百分率,进一步说明AST对A?,DEX协同A?引起的海马神经元损伤有保护作用,这可能与AST能明显降低A?和DEX+A?引起的升高的海马神经元[Ca2+]i、降低增高的海马神经元p-tau-Thr231蛋白表达水平、降低增加的海马神经元p53 mRNA水平以及直接清除超氧阴离子自由基和羟自由基的作用有关。

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研究一地塞米松协同促进β-淀粉样蛋白对大鼠海马神经元损伤的毒性及其机理研究

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 药品与试剂

2.1.3 仪器与设备

2.1.4 实验器材的准备

2.2 实验方法

2.2.1 整体实验

2.2.2 细胞培养及药物作用

2.2.3 细胞活力测定

2.2.4 细胞凋亡分析

2+的测定'>2.2.5 胞内Ca²⁺的测定

2.2.6 海马神经元总蛋白、胞浆和胞核蛋白样本的提取及蛋白定量

2.2.7 统计学处理

3 结果

25-35引起大鼠学习记忆能力下降作用的研究'>3.1 DEX 促进Aβ_25-35引起大鼠学习记忆能力下降作用的研究

3.2 DEX 协同促进Aβ引起海马神经元活力下降的作用

25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元的TUNEL 染色及凋亡率的影响'>3.3 DEX、Aβ_25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元的TUNEL 染色及凋亡率的影响

25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元DNA 损伤的影响'>3.4 DEX、Aβ_25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元DNA 损伤的影响

25-35诱导海马神经元胞内[Ca²⁺]i 增加的作用'>3.5 DEX 协同促进Aβ_25-35诱导海马神经元胞内[Ca²⁺]i 增加的作用

25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元NF-κB 和IκBα表达的影响'>3.6 DEX、Aβ_25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元NF-κB 和IκBα表达的影响

25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元p53 蛋白表达量的影响'>3.7 DEX、Aβ_25-35及DEX+Aβ_25-35对海马神经元p53 蛋白表达量的影响

25-35引起海马神经元p-tau-Thr231 蛋白表达量的增加'>3.8 DEX 协同促进Aβ_25-35引起海马神经元p-tau-Thr231 蛋白表达量的增加

4 讨论

5 小结

研究二黄芪总苷对Aβ和DEX 协同诱导大鼠海马神经元损伤保护作用及其机理的研究

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 药品与试剂

2.1.3 仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 AD 大鼠模型的制备和分组

2.2.2 水迷宫实验

2.2.3 病理形态学检查

2.2.4 胎鼠海马神经元培养，MTT 法检测细胞活力，胞内钙离子测定

2.2.5 RT-PCR

2.2.6 神经元凋亡检测和p-tau-Thr231 分析

2.2.7 黄嘌呤（Xanthine, X）-黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase, XO）系统产生（?）的检测

2.2.8 黄嘌呤氧化酶（XO）活力的检测

2.2.9 非酶体系产生（?）的检测

2+-H₂O₂体系产生OH 的检测'>2.2.10 Fe²⁺-H₂O₂体系产生OH 的检测

2.3 统计学处理

3 实验结果

3.1 AST 对AD 模型大鼠学习、记忆能力的影响

3.2 AST 对AD 模型大鼠海马病理组织学的影响

3.3 AST对Aβ和DEX＋Aβ引起海马神经元活力损伤的影响

3.4 AST 对Aβ 和DEX＋Aβ 引起海马神经元凋亡的影响

2+_i]的影响'>3.5 AST 对海马神经元[Ca²⁺_i]的影响

3.6 AST对Aβ和DEX＋Aβ引起海马神经元tau异常磷酸化的影响

3.7 AST 对海马神经元p53mRNA 表达的影响

3.8 AST 对体外黄嘌呤氧化酶和非酶体系产生超氧阴离子的影响

2+-H₂O₂体系（Fenton 反应）产生OH 引起苯甲酸羟化的影响'>3.9 AST 对 Fe²⁺-H₂O₂体系（Fenton 反应）产生OH 引起苯甲酸羟化的影响

4 讨论

5 小结

参考考献

附录

致谢

综述

参考文献

黄芪总苷对β-淀粉样蛋白和糖皮质激素协同诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机理的研究

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