大鼠肌源细胞自体移植治疗尿道括约肌损伤尿失禁的实验研究

论文摘要

目的：尿失禁（Urinary Incontinence，UI）是一种排尿自禁功能障碍性疾病，国际尿控协会（International Continence Society，ICS）定义为不能由意志控制的流尿现象，随着人口老龄化进程的加重，其发病率越来越高，UI虽然不危及患者的生命，但严重影响患者的生活质量。多数统计认为男性外伤或前列腺术后尿失禁的发病率为3％—40％，治疗上非常棘手。尿道固有括约肌结构及功能缺陷（intrinsic sphincter deficiency，ISD）是导致UI的关键机制之一，虽然正常机体存在成肌作用，但尿道括约肌的再生能力有限，所以患者存在明显的成肌功能障碍。男性外伤或前列腺术后UI的治疗方法众多，包括非手术治疗和手术治疗，非手术治疗包括药物治疗、盆底肌锻炼、生物反馈、电刺激、行为治疗等，疗效较差，外科手术治疗方法有：人工尿道括约肌植入术、球部尿道海绵体悬吊术、尿道粘膜下注射等。类似女性尿失禁，其中早期尿道粘膜下注射填充物质是治疗由ISD导致UI的有效方法之一，由于注射治疗具有安全、简便、微创的特点而逐渐受到医生和患者的重视和欢迎。目前常用的注射材料有特氟隆、胶原、自体脂肪、硅颗粒等，虽然近期疗效好，但远期效果不佳。理想的注射材料应该是安全、高效、持久、无免疫原性、不发生迁移。随着细胞组织工程的发展，人们利用细胞具有多潜能再生能力和可塑性的特点通过注射治疗恢复、替代和修复受损组织和器官，相关的基础研究已经广泛地开展。人们对骨骼肌细胞的生物学行为研究发现，骨骼肌内包含的成肌细胞（myoblast），通常情况下处于静止状态，肌肉损伤时能够分裂增殖，而肌源细胞（muscle derived cell，MDC）的分裂能力更强，它含有卫星细胞（satellite cell），后者具有干细胞的特征。类似的研究如治疗心肌梗塞，骨骼肌MDC心肌内注射后能长期存活并可改善心脏功能，而下尿路功能障碍，尤其是尿失禁病变位置表浅，易于注射，与其它材料相比，MDC是自身组织材料，不存在组织相容性问题，亦不怕注射物的远处转移。本实验应用大鼠尿道括约肌损伤尿失禁动物模型，肌源细胞自体移植，观察对括约肌损伤尿失禁的治疗作用，为MDC自体移植治疗尿失禁在临床上的应用提供实验依据。材料和方法：1．大鼠MDC的分离、纯化、培养、鉴定和转染：取成年健康SD大鼠，分离肌肉细胞后，胶原酶、分解酶及胰蛋白酶消化细胞，用鼠尾胶原铺被培养瓶，采用差速贴壁技术，按细胞贴壁的快慢将肌细胞分为PP1—PP6。培养瓶中培养1h，贴壁的细胞为PP1；未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶中培养2h，贴壁的细胞为PP2；未贴壁的细胞悬液再转入另一培养瓶中培养18h，贴壁的细胞为PP3；未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶中培养24h，贴壁的细胞为PP4；此过程重复（间隔24h）至PP6。贴壁细胞原代培养后传代培养，α—骨骼肌肌动蛋白对PP1—PP6细胞及分化后的肌管进行鉴定。用荧光染料Hoechst33258标记第二代PP5、PP6细胞。2．用烧灼尿道中段括约肌的方法建立大鼠尿失禁动物模型，通过尿道置管尿动力学检查和喷嚏实验检验动物模型的阳性率。用成功建立尿失禁的动物分组，注射组12只，照上述方法制取MDC，并转染Hoechst33258作标记，尿道注射；假注射组12只，DMEM培养基尿道注射；正常大鼠对照组6只，剖腹暴露尿道而不注射物质。注射组和假注射组在1、7、14、30天每组各取3只大鼠处死，制作尿道组织切片，观察注射细胞的生长情况和组织变化；三组于注射后1周、2周各取3只大鼠行尿动力学检查，从形态和功能上评估尿失禁的治疗效果。结果：1．通过差速贴壁技术获得肌源细胞，PP1、PP2细胞贴壁迅速，数量多，PP3以后数量减少，PP5、PP6数量更少，原代培养PP6细胞48小时后仍为圆形，72小时后开始贴壁，细胞由圆形变为梭形，体积增大，传代培养3代内细胞分布均匀，分裂旺盛，7代后细胞生长缓慢，变形裂解开始脱壁。分化培养后可见明显的肌管形成。2．免疫组织化学鉴定：α—骨骼肌肌动蛋白染色肌源细胞呈阳性，且PP1-PP6阳性率逐渐增高，在肌管为强阳性。这表明PP1、PP2主要是成纤维细胞，PP3以后肌源细胞含量逐渐增高，PP5、PP6为主要肌源细胞，并具有干细胞的特征。3．MDC的标记：荧光显微镜下，Hoechst33258染色的活细胞核呈蓝色，浅染，圆形，边界规则整齐，而凋亡细胞核内DNA浓聚，核碎裂，表现为体积明显缩小的深染核形态。4．尿失禁动物模型：烧灼尿道中段括约肌后，尿道置管尿动力学检查漏尿点压下降，喷嚏实验阳性率89％，表明尿失禁动物模型建立成功。5．Hoechst33258标记的MDC注射治疗：MDC制取并标记后，注射到细胞来源大鼠的尿道，并设立对照组。结果发现，注射后1天，细胞保持小圆形，局限于注射部位，14天左右荧光细胞呈长梭形，分布扩大，提示移植细胞在尿道内发生了有限的迁移，14后，部分荧光细胞逐渐变弱，一部分细胞失去正常的形态，提示移植细胞部分分化和融合，局部种植。6．耻骨上置管尿动力学检查：腹压漏尿点压（ALPP）在注射组、假注射组、对照组注射后一周三组分别为：20.48±1.08cmH2O、16.30±0.40cmH2O、24.46±0.35cmH2O（F=33.35，P＜0.01），注射后两周三组分别为：22.36±0.64cmH2O、18.44±0.80cmH2O、25.44±0.58cmH2O（F=59.58，P＜0.01），三组比较差异具有统计学意义，两两比较差异有统计学意义（P＜0.01）。MDC注射后能显著提高大鼠的ALPP，喷嚏实验阳性率显著下降，注射MDC组效果优于注射无血清培养基DMEM组，但与未注射组相比，注射MDC的尿失禁大鼠的控尿能力并不能完全恢复到正常。结论：1．采用差速贴壁技术和酶消化法可以成功分离、纯化培养MDC。2．α—骨骼肌肌动蛋白可以对骨骼肌MDC和肌管进行鉴定。3．烧灼尿道中段括约肌的方法可以成功建立大鼠尿失禁动物模型。4．荧光燃料Hoechst33258可以标记MDC。5．大鼠尿道括约肌损伤后近期MDC注射，可修复替代损伤的括约肌细胞，能显著提高腹压漏尿点压（ALPP），改善尿失禁大鼠的控尿功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 大鼠肌源细胞自体移植治疗尿道括约肌损伤 尿失禁的实验研究
• 前言
• 第一部分 大鼠骨骼肌肌源细胞分离纯化、培养和鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 尿道括约肌损伤尿失禁动物模型的建立和MDC自体移植
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述部分 细胞移植治疗尿失禁研究进展
• 参考文献
• 英文缩写表
• 致谢