大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体构建及佐剂功能研究

论文摘要

产肠毒素大肠杆菌产生的热敏性肠毒素（Heat-labile enterotoxin,LT）具有粘膜免疫原性和免疫佐剂功能,但具有很强的毒性,只有降低或去除LT蛋白的毒性,才能有效地利用其佐剂功能。为了得到安全性好的LT蛋白,选择其毒性关键位点63、72和192进行双突变研究,以期获得无毒但具有免疫佐剂功能的热敏性肠毒素。以pET30a-LTK63、pET30a-LTR72质粒为模板,利用重叠延伸PCR扩增技术体外获得LT双突变体LTK63/G192、LTR72/G192基因,双酶切处理双突变体和pET30a载体,构建了pET30a-LTK63/G192、pET30a-LTR72/G192表达载体,PCR和酶切鉴定出阳性质粒进行测序,结果表明构建的表达载体阅读框架正确,突变体在192位点引入甘氨酸密码子（AGA→GGA）。重组质粒转化BL21（DE3）菌株,IPTG诱导,诱导表达产物用SDS-PAGE检测,各菌株均表达出约33kDa和13kDa的两个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量相吻合。Western-blot检测,诱导表达的33KD、13KD蛋白均可与抗His抗体发生特异性免疫反应。表达蛋白用Ni-NTA Resin进行纯化,胰酶处理后,以DEABAG为底物,检测重组蛋白的ADP-核糖转移酶活性。结果,重组蛋白酶活性均显著低于野生型蛋白,而与阴性对照PBS相近。Patent-mouse毒性试验检测显示,LTK63/G192,LTR72/G192双突变体蛋白毒性均有不同程度降低,二者与LT相比差异均极显著,与PBS差异显著,且LTR72/G192的毒性略高于LTK63/G192。LTK63/G192、LTR72/G192、LT蛋白分别与鸡新城疫低毒力活疫苗（NDV）一起经滴鼻免疫小鼠、雏鸡。经间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体、鼻液IgA抗体水平。结果,NDV与LT双突变体蛋白免疫小鼠、雏鸡的血清IgG、局部粘膜IgA抗体水平均高于单独使用NDV免疫组,且LTR72/G192组抗体水平高于LTK63/G192组。经MTT法分析鸡脾脏T淋巴细胞增殖反应,结果发现,LT及LT双突变体蛋白免疫组的T淋巴细胞增殖反应均高于单独使用NDV免疫组及PBS空白对照但,但LTR72/G192与NDV免疫组T淋巴细胞增殖能力最强。研究获得了减毒LT双突变体LTR72/G192、LTK63/G192表达载体,并证实其表达产物ADP-核糖转移酶活性和Patent-mouse毒性均低于LT野生性蛋白,且均具有良好粘膜佐剂活性,为临床开发其利用粘膜免疫佐剂功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 引言
• 第一章 文献综述 大肠杆菌热敏性肠毒素作为粘膜免疫佐剂的研究进展
• 1 LT 的理化性质及分类
• 2 LT 的分子结构及生物学特性
• 3 LT 的功能
• 4 LT 作为佐剂的研究
• 4.1 ADP-核糖转移酶失活突变体的研究
• 4.2 胰酶敏感位点突变体LTG192 的研究
• 4.3 LTB 的研究
• 第二章 实验部分
• 实验一 大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体（LTK63/G192 、LTR72/G192）基因的克隆及表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料及溶液配制
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 LTK63/G192 表达载体构建
• 2.2 LTR72/G192 表达载体构建
• 2.3 突变体阳性质粒测序结果
• 3. 讨论
• 实验二 LT 双突变体重组蛋白的表达及毒性活性检测
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料与溶液配制
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 重组质粒的表达
• 2.2 蛋白的Western-blot 检测
• 2.3 重组蛋白的纯化
• 2.4 BCA 蛋白定量结果
• 2.5 ADP-核糖转移酶实验标准曲线绘制
• 2.6 ADP-核糖转移酶活性检测结果
• 2.7 小鼠毒性实验
• 3. 讨论
• 实验三 LT 双突变体的粘膜佐剂活性研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料与溶液配制
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 血凝实验的结果
• 2.2 小鼠免疫水平检测
• 2.3 鸡免疫水平检测
• 3. 讨论
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表