Kupffer细胞表达的Fas配体在急性胰腺炎肝损伤中的作用

论文摘要

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是一种多系统疾病,其不但累及胰腺,而且累及肝、肺、肾脏等器官,在重症时死亡率高达20%～30%。目前认为单核巨噬细胞系统异常激活并产生过多的细胞因子是AP时多器官功能不全综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）发生的主要机理。由于胰腺血液在回流心脏前需经过肝脏的代谢和处理,而肝脏的Kupffer细胞占整个单核巨噬细胞系统的80%-90%,是体内最大的固定巨噬细胞群,因此肝脏是AP常累及的胰外器官之一,其对AP的病情发展也可能有重要影响。而且,肝功能损害已被认为是判断AP严重程度的重要指标,已作为独立的指标合并进了预测AP严重程度的Ranson评分和急性生理慢性健康评估Ⅱ（Acute PhysiologicalChronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ）系统,对预测AP临床预后尤为重要。早在1984年就有报道,80%AP患者有肝功能损害,血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase,AST）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平升高,并且LDH水平与AP的严重程度呈正相关。实验研究表明,AP时可见明显的肝细胞病理改变。光镜下,可见肝细胞变性、散在的液化性坏死灶,Kupffer细胞肿胀。电镜下,可见糖原颗粒减少;脂质小滴大小和数目增加;线粒体肿胀,其基质和嵴变性;自噬体和溶酶体增多;肝窦内皮损害伴吞噬细胞活性增加。并出现肝细胞内酸中毒、钠离子超载及肝细胞生物能的耗竭等生化改变以及肝细胞凋亡显著增多。关于AP时肝脏损伤的发病机制尚未完全阐明,可能累及多种因素,主要包括:胰酶、氧自由基、一氧化氮以及细胞因子等。关于胰酶在AP时肝脏损伤过程中的作用,将胰弹性蛋白酶注入小鼠腹腔,发现血清AST、ALT、LDH显著升高,肝脏中性粒细胞浸润增加,与缺乏胆碱的乙硫氨酸饮食诱发的小鼠AP时肝损伤表现相一致;注射胰弹性蛋白酶30 min后发生核因子κB（Nuclearfactor-kappa B,NF-κB）激活;胰弹性蛋白酶腹腔注射和缺乏胆碱的乙硫氨酸饮食均可导致小鼠血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）蛋白和肝脏TNF-αmRNA表达增强;p38-促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase,MAPK）抑制剂CNI-1493可降低肝脏酶学改变、髓过氧化物酶活性、TNF-αmRNA及其蛋白表达。提示肝脏暴露于胰弹性蛋白酶可导致与AP相似的肝脏炎症和损伤;抑制肝脏内白细胞产生的炎症介质可减轻肝损伤。已有认为胰弹力蛋白酶诱导肝脏产生细胞因子的机制是通过激活Kupffer细胞内NF-κB,钆通过抑制NF-κB激活对胰弹力蛋白酶诱导的肝损伤发挥保护作用。最近实验研究表明胰弹性蛋白酶是通过直接激活全身性炎性细胞而使胰腺局部炎症扩散至全身的主要因素。目前,细胞因子在AP发病机制中的作用已成为研究和讨论的热点。研究表明,AP肝损伤是通过肝组织内巨噬细胞（Kupffer细胞）产生的TNF介导的。然而,TNF介导的肝细胞凋亡不能完全解释肝实质细胞损伤的严重程度。Kupffer细胞产生的其他细胞因子是否参与AP肝损伤,目前还不很清楚。Fas是属于TNF受体家族的一种细胞表面蛋白,而Fas配体（Fas Ligand,FasL）是TNF家族的成员之一。FasL由激活的淋巴细胞（如T细胞和NK细胞）产生,其功能是作为这些细胞毒细胞的效应子来清除被病毒及细菌感染的细胞或新生物细胞。虽然有报道表明FasL介导的凋亡在肝病、急性肾衰竭和甲状腺炎的实质细胞损伤中起着重要的作用。然而,关于AP时在Kupffer细胞中FasL的表达及其在肝细胞损伤中的作用,却少见报道。基于此,本研究将通过体内实验建立AP模型,利用ELISA、Western blot等技术研究实验性AP肝损伤时Kupffer细胞FasL的表达情况,并通过氯化钆进行干预研究,结合肝功能、病理形态学改变,明确Kupffer细胞和肝细胞之间的相互作用,以从分子水平阐明AP肝损伤的发病机制,为AP肝损伤临床治疗提供一个新的思路。【目的】以AP肝损伤作为研究对象,通过动物实验对肝脏Kupffer细胞表达的FasL在其中的作用及Kupffer细胞抑制剂氯化钆（Chloridate gadolinium,GdCl3）对肝损伤的保护作用进行观察,以期对AP疾病进程中胰外器官损伤发生率高、病死率高的原因进行初步探讨,为临床最终达到提高AP疗效、减少AP的并发症及降低其病死率提供理论及实验依据。【材料和方法】雄性美国癌症研究所（Institule of Cancer Researcch,ICR）小鼠54只（20-25g）,随机分为正常对照组（n=6）、AP组（n=24）和GdCl3预处理+AP组（AP+Gd组,n=24）,后两组均以不同的时间点分为4个亚组,每组6只。正常对照组予腹腔注射生理盐水0.1ml后4h心脏穿刺抽血,并处死小鼠,留取标本;AP模型制备采用间隔4h共1-6次不等腹腔注射胆囊收缩素类似物雨蛙素（50μg/kg次）;AP+Gd组在诱发AP前24h尾静脉注射GdCl3（10mg/kg）,然后注射雨蛙素诱发AP（方法同AP组）。AP组和AP+Gd组最后分别在诱发AP后4h、8h、16h、24h心脏穿刺抽血,并处死小鼠,留取标本。用自动生化仪检测血清ALT、AST、LDH和淀粉酶（amylzyme,AMY）的浓度、用ELISA试剂盒检测血清FasL水平和用western blot检测肝脏FasL蛋白的表达。本研究所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示,数据统计分析使用SPSS13.0软件,计量资料第一部分采用单因素方差分析,第二部分采用2×4析因分析,P<0.05为差异有统计学意义。【结果】（1）诱发AP后4h、8h、16h和24h血清AST、ALT、LDH、AMY水平明显高于正常对照组（P<0.05）,而用Kupffer细胞抑制剂GdCl3预处理则明显降低AP时预期升高的各个检测时间点血清AST、ALT、LDH、AMY水平（P<0.05）。（2）诱发AP后4h、8h、16h和24h AP组血清FasL浓度（505.94±36.2l,496.60±33.65,476.64±22.66,450.75±38.21）显著高于正常对照组（83.60±7.75）,上述结果和正常对照组相比差异显著（P<0.05）;GdCl3预处理组在4h、8h、16h和24h时血清FasL浓度（211.37±24.86,201.51±18.32,197.48±17.68,190.8±20.78）显著低于AP组相应各时间点的浓度,和AP组结果相比差异显著（P<0.05）。（3）诱发AP后4h、8h、16h和24h肝脏FasL蛋白的表达相比正常对照组明显增加,和正常对照组相比差异显著（P<0.05）;用GdCl3预处理则明显减少肝脏FasL蛋白的表达,和AP组结果相比差异显著（P<0.05）。【主要结论】（1）AP病程中,Kupffer细胞在炎症反应放大、胰外器官损伤中起着重要的作用。（2）AP时,Kupffer细胞表达的FasL上调介导肝细胞损伤,其可能是通过活化的TNF受体家族成员Fas,FasL激活Fas相关的死亡域和暴露死亡效应结构域随后活化caspase级联反应,最终导致DNA裂解和肝细胞凋亡。（3）GdCl3可显著减轻AP肝损伤,其可能是通过抑制FasL的表达,从而抑制肝细胞的凋亡通路进而达到保护作用,提示针对Kupffer细胞的抑制治疗有望成为控制AP发生发展及发现保护肝脏的新靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• Kupffer细胞表达的Fas配体在急性胰腺炎肝损伤中的作用
• 前言
• 第一章 Fas配体在急性胰腺炎肝损伤中的作用
• 1.1 前言
• 1.2 材料和方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 参考文献
• 第二章 氯化钆对急性胰腺炎并发肝损伤的保护作用
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 参考文献
• 实验附图
• 全文总结
• 英文缩略词表
• 文献综述1 IL-18在急性胰腺炎中的作用
• 文献综述2 Fas/FasL在急性胰腺炎肝损伤中的作用
• 在读期间所写论文
• 致谢
• 统计学审稿证明