导读:本文包含了单链二硫键稳定抗体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:单链二硫键稳定抗体,亲和力,原核表达,破伤风痉挛毒素C端
单链二硫键稳定抗体论文文献综述
王晗,于蕊,张晓鹏,任军,谢娜[1]（2013）在《人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达》一文中研究指出目的构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并进行原核表达和生物学特性鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,获得二硫键稳定的抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)单链抗体基因(27G-scdsFv)。连接pET22b(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot法鉴定表达产物。ELISA检测27G-scdsFv体外抗原特异结合活性和抗体相对稳定性;非竞争酶免法检测抗体亲和力。采用免疫荧光法检测27G-scdsFv体外中和活性。结果测序结果显示获得正确的27G-scdsFv基因。原核表达scdsFv以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的50%。复性后的27G-scdsFv保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,亲和力较其scFv形式略有提升,KD=0.93×10-7mol/L,1 L培养物可获得5 mg scdsFv蛋白。27G-scdsFv的稳定性较scFv形式明显增强。27G-scdsFv在体外可以明显抑制TeNT-Hc与神经元细胞的结合。结论成功构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并获得有活性的目的蛋白,为27G-scdsFv的进一步生物学功能研究奠定基础。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2013年01期）
殷幼平,李蒙,于红,吴瑜佳,王中康[2]（2011）在《柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的构建、表达和特性》一文中研究指出柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease,CBCD)是危害柑橘(Citrus reticulata Blanco)的重要病害,为了给柑橘溃疡病的现场快速诊断提供一种稳定的重组抗体,构建一种快速检测技术,本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsFv为模板进行基因改造,利用重迭延伸PCR在其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)5'端12个氨基酸的序列作为连接肽,构建重组单链二硫键稳定抗体基因sc-dsFv。将获得的基因连接pET24a(+)载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。表达产物经体外复性并以Ni-NTA亲和层析对目标蛋白sc-dsFv进行纯化,利用斑点免疫杂交、ELISA和BIAcore检测抗体的活性、稳定性、特异性及亲和力。构建的抗体基因经测序结果表明,抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因之间成功引入目标连接肽序列,重组sc-dsFv蛋白实现了原核高效表达;通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度高于90%的sc-dsFv蛋白。特异性和亲和性测定结果表明,该重组抗体具有特异的抗原结合活性和良好的抗原亲和力,与本实验室保存的抗柑橘溃疡病菌表面脂多糖scFv及dsFv比较,产量有明显提高且稳定性也有所提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定抗体sc-dsFv的获得为柑橘溃疡病的快速免疫诊断提供了高效优质重组抗体,并为病害治疗性抗体制备提供了有效的方法。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2011年01期）
杨瑞梅,杨松涛,王承宇,高玉伟,单虎[3]（2011）在《狂犬病人源二硫键稳定单链抗体融合蛋白的构建及活性检测》一文中研究指出【目的】构建、表达人源二硫键稳定单链抗体(scdsFv),检测其生物活性,以获得对狂犬病病毒有特异结合能力及中和活性的scdsFv蛋白。【方法】从GenBank上获得RV单抗SO57重链可变区VH和轻链可变区VL序列,在VH44和VL100位各突变一个氨基酸为半胱氨酸,用linker连接形成scdsFv,人工合成此序列,克隆入表达载体pET22b(+),在大肠杆菌中表达目的蛋白,镍柱亲和层析法纯化,并进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定。ELISA法和鼠脑组织抹片方法检测scdsFv对RV的特异结合活性;硫氰酸盐洗脱法测定scdsFv蛋白对RV的相对亲和力指数;分别用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和小鼠体内中和试验测定scdsFv的体外和体内中和活性。【结果】成功获得RV人源二硫键稳定单链抗体序列,大肠杆菌中表达得到scdsFv蛋白;分子量约为30.0kDa,Western blot表明此蛋白能与抗His单克隆抗体发生特异性反应。scdsFv能与RVVero疫苗特异结合,且结合力随抗原浓度降低而降低;scdsFv能与鼠脑组织中的RV结合。FAVN法测得scdsFv的中和效价为41IU/mL;小鼠体内中和试验表明scdsFv能保护55.6%鼠耐过强毒攻击。【结论】获得的scdsFv,具有良好的RV结合活性和体内外中和活性,有可能被用于暴露后狂犬病的预防。(本文来源于《微生物学报》期刊2011年01期）
李黄金,陈伟,赵林,柴伟佳,唐伟[4]（2010）在《二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建》一文中研究指出为构建一种食品残留检测用二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体(sdsFvCAP)。以抗氯霉素抗体可变区基因为模板,通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别引入一个半胱氨酸定点突变,以重迭延伸PCR组装成sdsFvCAP。在大肠杆菌系统强启动子T7驱动下,sdsFvCAP基因不能单独表达,而通过同义突变降低其5'端序列GC含量则可实现高效表达。表达产物主要以包涵体形式存在,经β-环糊精分子伴侣系统复性可获得亲和力与母本抗体相似的sdsFvCAP。所构建的sdsFvCAP具有取代单克隆抗体用于氯霉素残留检测的潜力。(本文来源于《食品科学》期刊2010年21期）
李蒙[5]（2010）在《柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的设计构建与表达》一文中研究指出柑橘溃疡病(Citrus Bacterial Canker Disease,CBCD)是危害世界柑橘产业的重要病害之一,为国内外检疫的重要对象。在我国柑橘产区都有发生,南方各省尤为严重,它是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)引起,病菌主要侵染芸香科植物,以甜橙、脐橙、酸橙、柠檬等品种,危害柑橘叶片、枝梢、果实,以苗木、幼树受害最重,造成落叶、枯梢、树势衰弱、落果等,严重影响产量和品质。可危害芸香科数十种植物,传播途径广、传染迅速、危害严重,顽固难防。当前田间主要使用铜基杀菌剂和抗生素制剂,但防效不佳,而对于已患病的植株则采取连根拔除,集中焚毁的手段进行根除。目前我国正在进行柑橘非疫区建设,因此开展柑橘溃疡病菌的快速、灵敏和准确的检测技术研究具有重要意义。单链抗体(single chain antibody,scFv)是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段,分子量约为完整抗体分子的1/6,其优越性在于可通过包涵体大量表达、易于基因工程操作,尤其易于构建抗体融合蛋白,基于这些特点,重组抗体在医疗领域的应用前景已引起广泛的关注。重庆大学基因工程研究中心利用柑橘溃疡病菌制备了柑橘溃疡病菌的单链重组抗体及二硫键稳定性抗体,但是scFv的稳定性欠佳,并且容易发生聚集,在制备过程中难以得到较高浓度的活性蛋白。二硫键稳定Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragments,dsFv)比单链抗体更加稳定,但是该种抗体也具有产量很低且复性效率不高的缺陷。为此,采用在二硫键稳定抗体dsFv的基础上再引入一条连接肽序列以连接VH和VL基因的方法,将这两种抗体的优点集合研发一种新型抗体,即获得了稳定性更佳的单链-二硫键稳定抗体(single chain disulfide-bond Fv, sc-dsFv)抗体。本研究的目的在于针对柑橘溃疡病scFv抗体稳定性较差及dsFv抗体具有的产量很低且复性效率不高的缺陷,构建一种稳定性和复性效率都较高的新型抗体,以克服前二者的缺陷,并为今后柑橘溃疡病菌Xcc的免疫诊断和防治研究提供新的工具和途径。研究的主要内容包括:在实验室已经获得二硫键稳定抗体的基础上本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsFv为模板,利用重迭延伸PCR在重链可变区VH和轻链可变区VL之间引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)的5’端12个氨基酸的序列作为连接肽,构建重组单链二硫键稳定抗体基因,将其连接入pET24a(+)原核表达载体并转化入表达菌株E.coli BL21(DE3),经表达、复性并纯化后得到高纯度的sc-dsFv抗体,并对其特异性、亲和力和稳定性进行测定研究。本研究已获得主要研究结果如下:①分别以dsFv-VL基因和dsFv-VH基因为模板通过一轮PCR扩增,在重链可变区VH和轻链可变区VL之间分别引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)的5’端12个氨基酸的序列作为连接肽,再经过一轮重迭延伸PCR将轻链基因与重链基因融合构建sc-dsFv重组抗体基因,经测序结果表明基因序列正确,连接肽序列被成功引入两段基因之间。②构建好的基因序列经酶切后连接表达载体pET24a(+),并转化入原核表达菌种BL21(DE3)中。通过IPTG诱导,获得包涵体表达蛋白。对所表达蛋白进行SDS-PAGE电泳及Western blot杂交,电泳结果显示目标蛋白分子量为30kDa,Western blot杂交结果显示目标蛋白表达正确与预期构想一致,即重组抗体sc-dsFv成功在原核表达载体中以包涵体形式超表达,经计算每百毫升菌液产包涵体约0.2g。③诱导表达获得的sc-dsFv包涵体经盐酸胍溶解后稀释于复性缓冲液中复性,利用Ni-NTA柱对复性后的Xcc-sc-dsFv进行纯化,灰度分析表明其纯度约为90%。④用大分子相互作用仪(biacore)分析Xcc-sc-dsFv抗体的亲和力,结果表明Xcc-sc-dsFv对其抗原Xcc的脂多糖LPS具有较高的亲和力,结合常数(ka)为5.31×106 M-1·s-1,解离常数(kd)为5.53×10-2 s-1,亲和常数(KD)为1.04×10-8M;Dot-blot和ELISA的特异性检测,显示出sc-dsFv抗体对目的抗原菌Xcc特异性结合活性良好,对其它十种近源菌无结合活性。⑤以抗柑橘溃疡病scFv抗体和dsFv抗体为对照,检测所获得的sc-dsFv的贮存稳定性。结果显示,在各种温度处理中,叁种抗体中,scFv的贮存稳定性最低,dsFv的贮存稳定性次之,sc-dsFv的稳定性最高。在37℃条件下,scFv在12 h内,活性急剧下降到最初活性的23.7%,dsFv在12 h后活性部分下降并在72 h后保持最初活性的63.2%,而sc-dsFv的活性一直略高于dsFv直到48小时后基本与其一致。scFv在35℃孵育3 h活性迅速下降至最初的17.2%,已经基本失活,45℃孵育3 h后dsFv仍具有58.6%的活性,在55℃孵育3 h后基本无活性,sc-dsFv在45℃-55℃之间的活性略高于dsFv。在-20℃冻存试验中scFv的活性在一周之内下降至20%左右,在60天之内活性完全消失。dsFv和sc-dsFv的活性随着时间的推移都有所下降,在第150天后前者的活性降低至50%左右,而sc-dsFv活性保持在70%左右。说明sc-dsFv抗体的稳定性与dsFv相比有了一定的提高。(本文来源于《重庆大学》期刊2010-04-01）
凌媛,徐静,许丽锋,崔文禹,李媛媛[6]（2009）在《二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定》一文中研究指出目的构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定。方法利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变的方法,构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosy)l对表达的目的蛋白进行可溶性纯化,并进行抗原结合活性、相对稳定性及细胞毒中和活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。抗TNF-α的ds-scFv的表达量占菌体总蛋白的16.6%,主要以包涵体形式表达;纯化的目的蛋白纯度可达94.4%;经ELISA及Western blot验证,ds-scFv与TNF-α抗原的结合活性与scFv相近;相对稳定性优于scFv;在同样的抗体浓度下,scFv和ds-scFv的细胞毒中和活性略低于亲本鼠单抗,ds-scFv略高于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达质粒,并获得有活性的目的蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2009年08期）
佟敬山[7]（2008）在《抗HIV-1 gp41二硫键稳定单链抗体及其重组导向毒素的表达及活性测定》一文中研究指出对已有的抗HIV-1gp41单链抗体(41)基因进行定点突变获得抗HIV-1gp41二硫键稳定单链抗体(d41)基因,同时通过PCR方法获得金黄色葡萄球菌外毒素(SEA′)基因,并将SEA′基因插入d41基因上游构建成重组导向毒素(sd41)基因。将d41和sd41基因分别克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,获得pET-d41和pET-sd41原核表达质粒。利用大肠杆菌表达系统,对d41和sd41基因进行了原核表达。表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在。通过Ni-NTA亲和层析的方法对包涵体成功地进行了纯化,并利用尿素梯度透析法对纯化蛋白复性。通过与亲本抗体比较,表明抗HIV-1gp41二硫键稳定的单链抗体(d41)及以其为弹头的重组导向毒素(sd41)抗原亲和性略有下降,但稳定性有明显提高。该结果为进一步研究抗HIV制剂奠定了坚实的基础。(本文来源于《长春理工大学》期刊2008-04-01）
佟敬山,李昌,金宁一,于源华,刘玉生[8]（2008）在《二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达》一文中研究指出目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2008年03期）
蔡昆,王慧,包士中,史晶,侯晓军[9]（2007）在《人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达》一文中研究指出以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b(+)载体,转化入E.coli BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。(本文来源于《微生物学报》期刊2007年04期）
王建丽,郑玉玲,王保莉,郭霭光,马茹[10]（2006）在《二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析》一文中研究指出目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重迭PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b)。测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体。IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用。结果双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右。复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,最大杀伤率可达96%。该蛋白在37℃孵育16h后,仍能保持大部分活性。结论所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2006年01期）
单链二硫键稳定抗体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease,CBCD)是危害柑橘(Citrus reticulata Blanco)的重要病害,为了给柑橘溃疡病的现场快速诊断提供一种稳定的重组抗体,构建一种快速检测技术,本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsFv为模板进行基因改造,利用重迭延伸PCR在其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)5'端12个氨基酸的序列作为连接肽,构建重组单链二硫键稳定抗体基因sc-dsFv。将获得的基因连接pET24a(+)载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。表达产物经体外复性并以Ni-NTA亲和层析对目标蛋白sc-dsFv进行纯化,利用斑点免疫杂交、ELISA和BIAcore检测抗体的活性、稳定性、特异性及亲和力。构建的抗体基因经测序结果表明,抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因之间成功引入目标连接肽序列,重组sc-dsFv蛋白实现了原核高效表达;通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度高于90%的sc-dsFv蛋白。特异性和亲和性测定结果表明,该重组抗体具有特异的抗原结合活性和良好的抗原亲和力,与本实验室保存的抗柑橘溃疡病菌表面脂多糖scFv及dsFv比较,产量有明显提高且稳定性也有所提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定抗体sc-dsFv的获得为柑橘溃疡病的快速免疫诊断提供了高效优质重组抗体,并为病害治疗性抗体制备提供了有效的方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
单链二硫键稳定抗体论文参考文献
[1].王晗,于蕊,张晓鹏,任军,谢娜.人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达[J].细胞与分子免疫学杂志.2013
[2].殷幼平,李蒙,于红,吴瑜佳,王中康.柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的构建、表达和特性[J].农业生物技术学报.2011
[3].杨瑞梅,杨松涛,王承宇,高玉伟,单虎.狂犬病人源二硫键稳定单链抗体融合蛋白的构建及活性检测[J].微生物学报.2011
[4].李黄金,陈伟,赵林,柴伟佳,唐伟.二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建[J].食品科学.2010
[5].李蒙.柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的设计构建与表达[D].重庆大学.2010
[6].凌媛,徐静,许丽锋,崔文禹,李媛媛.二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定[J].中国生物制品学杂志.2009
[7].佟敬山.抗HIV-1gp41二硫键稳定单链抗体及其重组导向毒素的表达及活性测定[D].长春理工大学.2008
[8].佟敬山,李昌,金宁一,于源华,刘玉生.二硫键稳定的抗HIV-1gp41单链抗体的构建及原核表达[J].中国生物制品学杂志.2008
[9].蔡昆,王慧,包士中,史晶,侯晓军.人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达[J].微生物学报.2007
[10].王建丽,郑玉玲,王保莉,郭霭光,马茹.二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析[J].细胞与分子免疫学杂志.2006