论文摘要
本实验室应用荧光标记的mRNA差异显示技术分析了40例临床胃癌组织、癌旁组织之间表达基因的差异,确定了在基因的mRNA水平上在胃癌及癌旁组织中具有显著差异表达的基因S100P。S100P属于S100基因家族,位于染色体4p16处。近年来研究表明,S100P基因与肿瘤的发生进展关系密切,其表达在多种恶性肿瘤中明显增高,但对于S100P的功能却不清楚。 本研究采用了经典的分子生物学研究路线,即从基因表达蛋白,再制备抗体,从而获得抗S100P的高纯度和高特异性多克隆抗体,为临床胃癌检测提供重要依据和奠定基础。首先通过RT-PCR方法扩增S100P基因全长CDs序列,并将目的基因克隆至原核表达载体pET-22b（+）;并随后将阳性克隆导入大肠杆菌BL21（DE3）PlysS中进行诱导表达;利用pET-22b（+）载体在其多克隆位点末端含有多聚组氨酸的特点,通过Ni2+纯化柱进行亲和层析纯化;将纯化的S100P蛋白免疫BALB/C小鼠,制备抗S100P蛋白的多克隆抗体;进而通过Western印迹,在验证抗S100P蛋白多克隆抗体特异性的同时,即可为验证S100P基因在蛋白水平上是否与胃癌的发生、进展密切相关提供研究基础。 通过Western blot印迹实验结果显示,在抗S100P的多克隆抗体以1:16000稀释的情况下,免疫印迹显示了相当好的效果,证明了S100P蛋白的高纯度及多克隆抗体的高特异性。这为进一步研究S100P基因在胃肿瘤中的变化情况及其在胃肿瘤发生、进展过程中的作用打下了基础。
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