论文摘要
水资源短缺已成为全球性危机,干旱是限制世界粮食作物生产的最主要因素。因此阐明植物抗旱机理,克隆干旱相关基因,应用现代分子生物学技术和传统育种相结合的手段培育抗旱性强的作物品种,实施节水栽培,不仅是可持续发展生产,保障粮食供给的关键,而且关系到缓解供水危机的大局。本研究以抗旱小麦（Triticum aestivum Linn.）石家庄8号幼苗为材料,采用同源克隆的方法,克隆到蔗糖转运蛋白（sucrose transporter, SUT）基因的cDNA序列全长；随后,构建植物亚细胞定位载体,采用绿色荧光蛋白（GFP）标记亚细胞定位技术,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） EH105侵染烟草,显微镜观察TaSUT1基因表达蛋白的定位情况；采用半定量RT-PCR及实时定量PCR,检测TaSUT1在干旱胁迫和干旱加葡萄糖信号分子胁迫诱导条件下SUT基因在小麦根、茎、叶中时空表达差异；构建该基因的过表达载体及RNAi载体,采用农杆菌侵染和基因枪轰击法转化小麦愈伤组织,研究己糖信号分子在干旱胁迫中的信号转导网络和调控机制,揭示SUT基因在干旱胁迫应答中的调控功能,阐明作物抗旱机制。主要研究结果如下：1.从20%PEG6000胁迫处理的小麦材料中克隆到1个蔗糖转运蛋白基因的cDNA全长,命名为TaSUT1。序列分析表明该基因的cDNA长1935 bp,包含一个1566 bp的开放阅读框,编码522个氨基酸,分子量55.072道尔顿,等电点8.102。氨基酸序列分析表明,TaSUT1与已公布小麦SUT氨基酸序列同源性达96%,与玉米SUT氨基酸序列同源性为90%。TaSUT1基因表达蛋白具有典型的12个跨膜区,属于易化扩散载体超家族（MFS）成员。2.在烟草细胞的定位结果表明,TaSUT1基因表达的蛋白定位在细胞膜上。3.半定量RT-PCR以及实时定量PCR检测结果表明,干旱胁迫提高了抗旱小麦品种TaSUT1基因在根、茎、叶中的表达,在叶片和根中尤为显著；干旱胁迫加葡萄糖处理下显著上调了TaSUT1的表达量,根中最为敏感；不抗旱品种在胁迫诱导下TaSUT1基因的表达受抑制。说明TaSUT1基因和葡萄糖信号在逆境应答中可能起着重要作用。4.构建了3个植物过表达载体TaSUT1-pCAMBIA1300,TaSUT1-pUB1::cas和TaSUT1-pMWB003。采用农杆菌侵染法将TaSUT1-pCAMBIA1300转化至小麦愈伤组织,在加筛选剂条件下,无再生植株；在不加筛选剂条件下,仅获得2株再生植株,其中无阳性植株,表明潮霉素筛选标记对小麦胚分化有抑制作用,不适宜再生体系的有效筛选。采用基因枪轰击法分别将TaSUT1-pUBI::cas和TaSUT1-pMWB003转化至小麦愈伤组织,用双丙氨膦PPT共筛选到216株抗性再生植株,通过PCR检测,筛选出3株阳性植株,阳性率1.4%。5.构建了3个植物RNAi载体R1,R2, R3-pMWB003,分别将3个载体通过基因枪轰击法转化至小麦幼胚,共得到280株抗性再生植株,通过PCR初步检测出7株阳性植株,阳性率为2.5%。相同转化条件下,R1-pMWB003载体转化获得97株抗性再生植株,R2-pMWB003载体转化获得153株再生植株,R3-pMWB003载体转化获得30株再生植株,说明TaSUT1基因的不同干扰片段在转化效率方面存在差异。