产虾青素海洋酵母菌YS-185的鉴定、发酵优化及保藏稳定性的研究

论文摘要

海洋酵母菌YS-185是由海洋产物资源与酶工程实验室保存的一株从海洋中分离出来的高产虾青素的酵母菌,本文针对该菌种使用26S rDNA法进行了鉴定;通过单因素及正交试验优化了该菌种的发酵条件,提高了其虾青素的产量;并以虾青素含量为指标,利用逐因子实验和Box-Behnken实验对海洋酵母菌YS-185胞内虾青素保护剂配方进行了优化研究。以26S rDNA法将实验室保藏的一株产虾青素的海洋酵母菌鉴定为粘红酵母。实验中菌体采取超声破碎法提取色素。将菌体超声破碎后低温高速离心（10000r/min,25min,4℃）,得到粗色素液,粗色素液经过有机溶剂萃取、减压蒸馏得到色素固体。运用高效液相色谱法（HPLC）对该红酵母菌产虾青素及其含量进行初步的检验。HPLC色谱条件:symmetry C18柱（5μm,2.1mm×150mm）;流动相为:甲醇:乙腈:四氢呋喃=80:5:15;检测波长478nm。制作浓度-峰标准曲线:标准虾青素浓度在1-6μg/mL范围内具有良好的线性关系,一次回归方程:y=120308x-35246,最小方差R2=0.9904。实验结果表明该菌所产色素中含有虾青素,通过计算峰面积计算出虾青素占总色素的69.3%,样品中的含量为24.3μg/ g干菌粉,加标回收率为98.1%。采取超声破碎法提取色素,运用高效液相色谱法测定虾青素含量,作为衡量发酵条件优化的指标。以海洋酵母菌YS-185为试验菌株,运用摇瓶发酵优化的方式,探索培养基组分和发酵工艺条件对该菌发酵的影响。实验结果表明,该菌生长最适培养基组分为葡萄糖8g/L、蛋白胨8 g/L,最适生长起始pH值为5.5、转速220r/min、接种量为8%、温度为20℃;虾青素合成的最佳培养基组分葡萄糖8g/L、蛋白胨8g/L,最适生长起始pH值为5.5、转速220r/min、接种量为8%、温度为25℃。发酵优化后的虾青素产量2.670μg/mL较优化前1.572μg/mL提高了69.8%。温度对酵母菌的生长和虾青素的合成有显著影响。采取分光光度法测定虾青素含量,并以此为指标,利用逐因子实验和Box-Behnken实验对海洋酵母菌胞内虾青素的保护剂配方进行了优化研究,获得了保护剂配方的优化数学模型Y=-0.08175+3.613x1 +1.715x2+0.2844x3 +0.4000x1x2- 0.5250x1x3+ 0.8000x2x3-8.250x12-10.35x22 - 0.3781x32。分别再对自变量求偏导得到优化的保护剂配方:x1=0.405,x2=0.241,x3=0.699,通过转换得到实际的保护剂配方,即最佳的保护剂配方:柠檬酸浓度0.22%、维生素C浓度0.11%、茶多酚浓度0.41%。在最优化的保护剂条件下进行重复性实验,实验的结果为0.401±0.003（n=3）,与软件估测值OD4800.404基本一致,这说明逐因子实验和Box-Behnken实验联用可以很好的应用于海洋酵母菌胞内虾青素的保藏,响应优化后的色素100天的保藏效果提高了44.24%。通过验证海洋酵母菌色素的还原能力及对羟自由基的清除能力来评价其抗氧化特性,并且用公认的抗氧化剂α-生育酚作对照。本实验中采用冻干的色素粉末,配置成0.1-0.4mg/mL样品液。实验结果表明在本实验浓度范围内海洋酵母的色素液的还原能力远大于α-生育酚;羟自由基的清除能力大于α-生育酚,海洋酵母色素的清除羟自由基的能力随着样品浓度的增加而加强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述-虾青素国内外研究进展
• 1 虾青素的化学结构、理化性质、生理功能和应用
• 1.1 虾青素的化学结构
• 1.2 虾青素的理化性质
• 1.3 虾青素的生理功能
• 1.4 虾青素的应用
• 2 虾青素的主要生产方法
• 2.1 化学合成法
• 2.2 天然提取法
• 3 微生物发酵法生产虾青素
• 3.1 虾青素产生菌和虾青素的生物合成途径
• 3.2 酵母发酵生产虾青素工艺的研究
• 3.3 色素的提取方法
• 4 虾青素的分析检测
• 4.1 虾青素的检测
• 4.2 虾青素含量的测定
• 第二章 海洋酵母菌 YS-185 的鉴定及高效液相色谱法测定胞内虾青素及含量
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 菌株与培养基
• 1.3 实验方法
• 1.4 色素的紫外可见光色谱吸收峰分析实验
• 1.5 色素的鉴定
• 1.6 测定色素的含量
• 1.7 加标回收实验
• 2 实验结果
• 2.1 菌落形态
• 2.2 分子鉴定
• 2.3 色素吸收扫描实验
• 2.4 高效液相色谱法（HPLC）测定海洋酵母色素
• 2.5 浓度-峰标准曲线
• 2.6 加标回收率实验
• 3 结果
• 第三章 产虾青素海洋酵母 YS-185 培养条件优化的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 主要仪器
• 1.4 生物量的测定
• 1.5 发酵条件的优化
• 1.6 虾青素提取和测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 碳源的选择
• 2.2 不同葡萄糖质量浓度对发酵培养的影响
• 2.3 氮源的选择
• 2.4 不同蛋白胨质量浓度对发酵培养的影响
• 2.5 初始pH 值对发酵培养的影响
• 2.6 不同转速对发酵培养的影响
• 2.7 接种量条件的优化
• 2.8 温度对发酵培养的影响
• 2.9 正交实验
• 3.0 摇瓶发酵
• 3 讨论
• 第四章 海洋酵母菌 YS-185 胞内虾青素保护剂配方的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 单因素实验结果
• 2.2 响应曲面优化保护剂配方
• 2.3 各因素的交互作用对保藏效果响应面的分析
• 2.4 最佳工艺条件及其验证实验
• 3 结论
• 第五章 海洋酵母菌 YS-185 色素抗氧化性质的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验菌株
• 1.2 试剂和仪器
• 1.3 酵母菌的培养基和培养条件
• 1.4 样品处理
• 1.5 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 红酵母色素的还原力测定
• 2.2 羟自由基清除能力测定[107]
• 3 结论
• 结论
• 参考文献
• 致谢