抗桔霉素单克隆抗体制备及其在红曲桔霉素检测中的应用

论文摘要

红曲,泛指红曲菌（Monascus spp.）在米饭或淀粉基质上生长发酵的产品。红曲在我国的应用至今已有一千多年的历史,是我国传统的特色发酵食品,主要生产地在福建、浙江、台湾等省,被广泛应用于食品发酵剂、食用色素、食品防腐剂、食品增香剂及中药的生产。然而自1995年,法国Blanc教授证实红曲中桔霉素的存在,使红曲的安全性受到质疑。目前桔霉素的检测方法主要是仪器检测方法,存在检测成本高、时间长和难于推广等缺点,因此,迫切需要建立一种经济、简便和快速的检测方法。本文采用活性酯法将桔霉素与载体蛋白连接,获得了桔霉素的完全抗原,通过杂交瘤细胞技术,制备了抗桔霉素的单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA,并分析了红曲中桔霉素含量。具体内容如下。1桔霉素人工抗原的构建桔霉素（citrinin,CIT）分子量为250.3,属于只有反应原性而无免疫原性的半抗原（hapten）,必须与蛋白质等载体结合构建成完全抗原才能刺激动物产生抗体。根据桔霉素具备活泼羧基基团的结构特点,采用活性酯法分别与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）偶联制备得到免疫抗原CIT-BSA和包被抗原CIT-OVA,偶联比分别为8.4:1和6.3:1。并采用紫外和红外光谱法对偶联产物进行了分析。2抗桔霉素单克隆抗体的制备及其ELISA的建立以CIT-BSA免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,融合率约为61.3%。采用有限稀释法,从阳性杂交瘤细胞株中筛选得到两株能稳定分泌高特异性、高灵敏度的抗CIT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5H1和7B7。以上述制备的抗原和抗体为材料,通过对包被条件、抗原抗体反应条件等研究,优化得到了CIT的间接竞争ELISA条件为:CIT-OVA用0.05 mol/mLpH 9.6的碳酸盐缓冲液在4℃包被12 h,包被浓度为2μg/mL,5H1和7B7所产腹水抗体用缓冲液（含0.05%（v/v）Tween-20的0.01mol/LpH7.4的磷酸缓冲溶液生理盐水,PBST）分别稀释为1:2 000和1:1 000,竞争抗原与抗体混匀37℃加入酶标板中反应1 h,然后加入酶标二抗（以PBST作1:4 000稀释）37℃反应1 h,加底物37℃反应10 min,用2 mol/L H2SO4终止反应,测定OD492m值。根据上述优化的ELISA条件,采用间接竞争ELISA,以竞争抗原CIT的浓度对数为横坐标,竞争抑制率为纵坐标,作图得到CIT对5H1和7B7抗体的竞争抑制曲线,CIT的检测灵敏度分别为24.95 ng/mL和33.78 ng/mL,线性方程分别y=-7.14x+72.97,（R2=0.962）,y=-7.83x+77.56,（R2=0.982）,线性范围均为2 ng/mL～200 ng/mL。同时,在上述优化条件下,研究了5H1和7B7分泌的抗体对黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1）和棒曲霉素（patulin）的特异性,结果表明,本研究所获得5H1及7B7分泌的抗体与以上毒素均无交叉反应。说明获得的两株细胞分泌抗体的特异性好。3红曲中的桔霉素加标回收及ELISA检测在经HPLC确证不含CIT的空白红曲样品中,分别添加不同浓度CIT,添加量在0.05μg/g～0.5μg/g时,经间接竞争ELISA分析,CIT的平均添加回收率为83.2%～94.4%,变异系数为6.3%～9.6%。在此基础上,选取来源不同的28株红曲菌制得红曲米,经ELISA检测,样品中桔霉素含量在0.005μg/g～6.001μg/g之间,其中3份样品未检测出桔霉素。并通过HPLC和间接竞争ELISA同时检测其中12株红曲样品,结果表明两者没有明显差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 红曲菌
• 1.1 红曲菌的生物学特征
• 1.2 红曲菌的分类
• 1.3 红曲菌代谢的产物
• 1.3.1 红曲色素
• 1.3.2 莫纳可林类物质
• 1.3.3 γ-氨基丁酸
• 1.3.4 抗菌活性物质
• 1.3.5 酶类活性物质
• 1.3.6 其他代谢产物
• 2 红曲中的桔霉素
• 2.1 桔霉素的理化性质
• 2.2 桔霉素的毒性
• 2.3 红曲菌中桔霉素的部分代谢途径
• 2.4 桔霉素的检测
• 2.4.1 比色法
• 2.4.2 薄层层析法（TLC）
• 2.4.3 高效液相色谱（HPLC）
• 2.4.4 气相色谱/质谱联用法（GC-MS）
• 2.4.5 酶联免疫吸附法（ELISA）
• 3 研究目的和意义
• 第二章 桔霉素完全抗原的构建与鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 桔霉素与 BSA的偶联
• 2.2 桔霉素与 OVA的偶联
• 2.3 人工抗原的光谱分析
• 2.3.1 人工抗原的红外光谱分析
• 2.3.2 人工抗原的紫外-可见光谱及其摩尔比分析
• 3 结果与分析
• 3.1 CIT-BSA（OVA）制备
• 3.2 人工抗原的红外光谱分析
• 3.3 人工抗原的紫外-可见光谱及其摩尔比分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第三章 抗桔霉素单克隆抗体的制备及性质分析
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂和材料
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 主要材料
• 1.3 主要试剂与培养液的配制
• 1.3.1 ELISA相关试剂的配制
• 1.3.2 培养液及相关试剂的配制
• 1.3.3 染色体制备相关试剂的配制
• 1.3.4 佐剂的制备
• 1.3.5 融合剂的制备
• 2 方法
• 2.1 抗桔霉素单克隆抗体的制备
• 2.1.1 技术路线
• 2.1.2 脾细胞的制备
• 2.1.3 骨髓瘤细胞的制备
• 2.1.4 饲养层细胞的制备
• 2.1.5 细胞融合
• 2.1.6 融合细胞的培养及筛选
• 2.1.7 有限稀释法亚克隆
• 2.1.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.1.9 杂交瘤细胞的染色体分析
• 2.1.10 细胞株稳定性试验
• 2.2 抗桔霉素单克隆抗体的性质研究
• 2.2.1 单克隆抗体的扩增
• 2.2.2 饱和硫酸铵二次盐析法初步纯化单克隆抗体
• 2.2.3 间接非竞争ELISA测抗体效价
• 2.2.4 抗原和抗体工作浓度的确定
• 2.2.5 间接竞争ELISA分析抗体的灵敏度
• 2.2.6 间接竞争ELISA分析抗体的特异性
• 2.2.7 单克隆抗体识别抗原位点分析
• 3 结果与分析
• 3.1 抗桔霉素单克隆抗体的制备
• 3.1.1 克隆的形成过程
• 3.1.2 杂交瘤细胞株的建立
• 3.1.3 杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性分析
• 3.1.4 杂交瘤细胞的染色体分析
• 3.2 单克隆抗体的性质研究
• 3.2.1 单克隆抗体的扩增及纯化
• 3.2.2 单克隆抗体和包被抗原工作浓度的确定
• 3.2.3 桔霉素间接竞争ELISA的竞争抑制曲线
• 3.2.4 单克隆抗体的特异性分析
• 3.2.5 抗体识别表位分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 细胞污染及处理方法
• 4.2.2 饲养层细胞的作用
• 4.2.3 培养液的注意事项
• 4.2.4 免疫动物抗原及免疫方法的注意事项
• 4.2.5 ELISA实验条件的优化
• 第四章 红曲中桔霉素的间接竞争 ELISA检测
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 红曲菌种
• 2 方法
• 2.1 红曲米的制备及桔霉素的提取方法
• 2.2 工作条件的选择
• 2.2.1 ELISA检测
• 2.2.2 高效液相色谱检测系统
• 2.3 标准曲线的建立
• 2.3.1 ELISA分析方法
• 2.3.2 HPLC分析方法
• 2.4 添加回收率的测定
• 2.5 间接竞争 ELISA和 HPLC测定红曲样品中桔霉素含量
• 3 结果与分析
• 3.1 标准曲线
• 3.2 加标回收样品中桔霉素的检测
• 3.3 间接竞争ELISA检测红曲样品中桔霉素
• 3.4 HPLC与ELISA测定结果的比较
• 4 小结与讨论
• 第五章 总结与讨论
• 1 总结
• 1.1 桔霉素人工抗原的合成
• 1.2 抗桔霉素单克隆抗体的制备
• 1.3 抗桔霉素单克隆抗体的性质研究
• 1.4 间接竞争 ELISA检测红曲中桔霉素
• 2 讨论
• 2.1 桔霉素人工抗原的合成
• 2.2 桔霉素单克隆抗体的种类
• 2.3 红曲中桔霉素的提取方法
• 参考文献
• 致谢
• 附录