供体NKT细胞输注促进小鼠皮肤移植耐受及其机理的研究

论文摘要

目的高效非特异性免疫抑制剂的迅速发展和临床广泛应用使同种器官移植取得了长足的进步，急性排斥率明显降低，器官短期存活率显著提高。但是数十年来，由于慢性排斥和免疫抑制剂的毒副作用，使得器官移植的长期存活率无明显改善。因此诱导特异性移植耐受，预防急慢性排斥反应，减少药物的毒副作用，避免长期服用免疫抑制剂就成为解决移植器官长期存活的关键问题。既往研究表明维持对同种异型抗原免疫耐受的重要机制之一是通过产生负调节性T细胞而实现的。NKT细胞（natural killer T cell）是一种新型的淋巴细胞，与T细胞和NK细胞不同，其同时表达T细胞表面受体和NK细胞表面标志，发育受CD1分子限制。近年来研究发现NKT细胞是调节免疫反应的重要细胞，在表型、抗原识别及免疫功能方面有其自身的特殊性，特别是近年来的研究认为NKT细胞在器官移植免疫耐受的产生和维持等方面具有重要的作用。本实验利用小鼠同种皮肤移植模型，研究受体小鼠体内预先注射NKT细胞对移植物存活时间、混合淋巴细胞反应、迟发型超敏反应、某些细胞因子及体内外过继转移实验的影响，同时与经典的抗排斥药物环孢霉素（CsA）对比进行研究，目的在于试图阐明NKT细胞免疫抑制及诱导耐受作用的机理，为研究利用NKT细胞诱导移植耐受提供实验依据。方法建立小鼠同种皮肤移植模型，尾静脉输注供体NKT细胞、移植后腹腔注射CsA及NKT细胞与CsA联合应用，术后逐日观察移植皮肤存活情况及小鼠一般状况；移植后14d，应用3H-TdR掺入法，研究NKT细胞和CsA对混合淋巴细胞反应的影响，对耐受小鼠做迟发型超敏反应，确定小鼠的耐受状态；并通过体内外过继转移实验、脾组织中细胞因子IL-10mRNA、IL-4mRNA、IL-2mRNA的表达情况，进一步探讨耐受形成的机制。结果1．与对照组相比，移植前尾静脉输注NKT细胞、移植后腹腔注射CsA及两者的联合应用可以明显延长移植皮片的存活期。2．移植前尾静脉输注NKT细胞可以明显抑制移植后14d的小鼠混合淋巴细胞反应。3．移植前尾静脉输注NKT细胞可以明显抑制超敏反应的发生。4．移植前尾静脉输注NKT细胞形成的移植耐受可被过继转移。5．移植前尾静脉输注NKT细胞可上调Th2型细胞因子IL-10、IL-4的表达，下调Th1型细胞因子IL-2的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 实验材料与方法
• （一） 实验材料
• 1. 分离小鼠肝脏中淋巴细胞的实验材料
• 2. 扩增单个核细胞中NKT细胞的实验材料
• 3. 建立同种皮肤移植模型的小鼠和相关实验材料
• 4. 混合淋巴细胞培养所用实验材料
• 5. 组织总RNA提取的实验材料
• 6. 转录反应的实验材料
• 7. PCR反应的实验材料
• 8. 使用引物设计软件进行引物设计，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物
• 9. DNA电泳实验材料
• 10. 实验用药
• （二） 实验方法
• 1. 分离小鼠肝脏中淋巴细胞的实验方法
• 2. 单个核细胞中NKT细胞的扩增
• 3. 小鼠同种皮肤移植模型的制备
• 4. 混合淋巴细胞培养
• 5. 迟发型超敏反应
• 6. TRIzol一步法提取组织总RNA
• 7. RT-PCR反应
• 8. PCR产物琼脂糖凝胶电泳
• 9. 体内过继转移实验
• 10. 体外过继转移实验
• 11. 实验动物分组
• 12. 统计学分析
• 实验结果
• 1. 耐受小鼠的同种皮肤移植物存活时间明显延长
• 2. 混合淋巴细胞反应的实验结果
• 3. 迟发型超敏反应结果
• 4. 细胞因子检测结果
• 5. 过继转移实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 论文综述
• 致谢
• 附录
• 学位论文评阅及答辩情况表