瑶山苣苔SSR引物开发及遗传多样性研究

论文摘要

瑶山苣苔（Dayaoshania cotinifolia W.T.Wang）是1983年由王文采在广西省大瑶山自然保护区内发现的苦苣苔科植物新种,为中国特有的单型属植物。苦苣苔科植物是一个处于剧烈分化的类群,瑶山苣苔是该科较原始的种,这就意味着该科的某些属和种适应能力弱化,具有较高的科研价值和经济价值。由于瑶山苣苔资源数量分布极其有限,生境特殊,分布范围狭窄,并受人为活动的影响,其种群数量和分布面积急剧减少。在1999年国务院颁布的《国家重点保护植物名录》（第一批）中被列为国家I级重点保护野生植物,被《中国植物红色名录》（第一卷）定为极危种（ Critically Endangered ）。弄清濒危物种的遗传多样性和遗传结构的现状,才能有效的制定出濒危物种的科学合理切实保护策略。分子标记能直接从DNA水平反映物种水平上的遗传差异,是研究植物遗传多样性的有效工具。SSR标记具有种属特异性高、多态性高、共显性及中性标记等诸多优点,目前被广泛应用于遗传多样性的研究。本试验应用自主开发的10对SSR标记引物对仅有的两个居群61个瑶山苣苔个体的遗传多样性进行了研究。主要结果如下:（1）成功构建了一个富含SSR序列的瑶山苣苔基因组文库,克隆培养后从中随机挑选克隆送样81个,其中含有SSR序列的高达64条,得率达79%。选择其中38条适于设计引物的序列设计并订购了引物对两个居群的10份DNA样品进行PCR扩增,其中15对引物可以得到清晰单一的目的条带,为了进一步在ABI3730测序仪上进行数据分析,需要对引物加上荧光接头。加上荧光接头后发现仍有10对引物可以扩增得到目的条带,最终就选择这10对引物对两个居群的全部个体进行PCR扩增并分析数据。（2）运用Arlequin311软件对瑶山苣苔两个居群共61个个体进行数据分析,发现有2个位点仅有一个等位基因,为单态,而在剩余的8个多态位点中,等位基因从2个到12个等,平均为4.5个。而对其杂合度的分析发现,在物种水平上,观测杂合度从0.01639到1不等,平均为0.50830;预期杂合度从0.01639到0.65831不等,平均为0.41556。其中有5个位点极显著的偏离Hardy-Weinberg平衡（P<0.01）,分别是JT14,JT26,JT29,JT17和JT34。还有1个位点JT21是显著的偏离Hardy—Weinberg平衡（P<0.05）。在基因对之间还检测到连锁不平衡。其中4对显著,P<0.05,分别是JT14与JT29,JT3与JT29,JT14与JT34,JT34与JT17。3对极显著,P<0.01,分别是JT29与JT34,JT14与JT34,JT17与JT34。（3）运用bottleneck软件对两个居群进行瓶颈效应检测,发现在不同的模型下,分别有一些位点观测杂合度显著或极显著的高于预期杂合度,但是等位基因频率分布图却是典型的“L”型,说明该物种并未经历瓶颈效应。推测可能是所用位点数目太少,通过我们的数据无法检测到该物种发生过瓶颈效应。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 保护遗传学概述
• 1.1.1 保护遗传学的概念
• 1.1.2 保护遗传学研究意义
• 1.2 保护遗传学研究方法
• 1.2.1 微卫星标记（SSR）
• 1.2.1.1 SSR 的类型
• 1.2.1.2 SSR 的多态性
• 1.2.1.3 SSR 标记分离技术的概述
• 1.2.1.4 SSR 标记的应用综述
• 1.3 苦苣苔科概述
• 1.4 瑶山苣苔概述
• 1.4.1 形态特征
• 1.4.2 分布与生境
• 1.4.3 生物学特性
• 1.4.4 现状
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 仪器及试剂
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 试剂
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 技术路线
• 3.3.2 基因组 DNA 提取
• 3.3.3 DNA 检测及稀释
• 3.3.3.1 DNA 质量检测
• 3.3.3.2 DNA 浓度稀释
• 3.3.4 SSR 引物开发
• 3.3.5 PCR 扩增
• 3.3.6 数据分析
• 3.3.6.1 原始数据处理
• 3.3.6.2 遗传多样性水平和居群遗传结构分析
• 3.3.6.3 瓶颈效应分析
• 4 结果与分析
• 4.1 DNA 提取方法筛选结果
• 4.2 SSR 引物开发结果
• 4.3 遗传多样性分析结果
• 4.3.1 等位基因分析结果
• 4.3.2 杂合度分析结果
• 4.4 瓶颈效应分析结果
• 5 讨论
• 5.1 SSR 的开发方法
• 5.2 瑶山苣苔的遗传多样性
• 5.3 瑶山苣苔濒危机制的探讨
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录