褪黑素合成酶基因对烟草和贯叶连翘的转化及转基因植株抗氧化能力的增强

论文摘要

褪黑素（melatonin,MT）是在脊椎动物松果体（pineal body）分泌的一种小分子的神经-内分泌（neuroendocrine）激素。褪黑素作为一种动物激素,可以调节脊椎动物生物节律和光周期反应,改善睡眠障碍,增强免疫等,并具有自由基清除剂和广谱抗氧化剂的作用。目前,在植物方面的褪黑素研究主要局限于对一些植物内源褪黑素含量的测定,对褪黑素在植物中的功能研究还刚刚开始,且报道很少,有关烟草（常用作转基因操作的模式植物）和中药植物贯叶连翘（Hypericum perforatum L.）的转褪黑素合成关键酶基因报道尚未见到。本研究通过根癌农杆菌介导的转化技术,将美国Vanderbilt大学Xu Yao博士馈赠的褪黑素生物合成酶------芳烷基胺N-乙酰转移酶（ArylalkylamineN-acetyltransferase,AANAT）与羟基吲哚O-甲基转移酶（HydfoxyindoleO-methyltransferase,HIOMT）基因,分别导入烟草和贯叶连翘中,获得了转基因植株,并测定和分析了两种转基因植物中褪黑素含量变化,以及外源基因在两种转基因植株中抗氧化方面的功能。所取得的主要研究结果如下:对含有AANAT-HIOMT基因的植物表达载体YXu55进行了鉴定,发现质粒YXu55插入的AANAT基因序列与数据库AANAT基因序列（序列号:U40347）同源性为100%,HIOMT基因序列与数据库HIOMT基因序列（A型,序列号:U11090）的HIOMT基因型A-6+7型相吻合,同源性为100%;AANAT与HIOMT基因表达盒以顺式相连,并同方向与庆大霉素抗性基因表达盒串联,常用相关酶切位点多是多位点。以叶片切块为外植体,通过不同激素配比的比较研究,建立了贯叶连翘的高效再生体系。在含有2,4-D1.0mg/L,NAA0.1mg/L的MS培养基上10～15d左右即形成愈伤组织且分化能力较强,在附加6-BA2.0mg/L,NAA0.2mg/L的MS培养基上可以诱导出大量芽,分化率达100%,并形成丛生苗。将小苗在附加NAA0.2mg/L的MS培养基上培养10d后即可诱导出根。在根癌农杆菌介导的转化过程中,分别探讨了外植体预培养时间、pZP122（仅含庆大霉素抗性标记,不含AANAT-HIOMT基因的空白质粒）和YXu55（含庆大霉素抗性标记和AANAT-HIOMT基因）两种农杆菌浸染浓度、时间对烟草和贯叶连翘两种植物转化频率的影响。两种植物外植体分别预培养2～3d,在OD600=0.5的农杆菌菌液感染25min,而后分别在60mg/L和50mg/L的庆大霉素作选择压力下,获得了两种植物的阳性转基因植株。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR分析,证实褪黑素合成过程中关键酶基因AANAT-HIOMT已经整合到烟草和贯叶连翘两种植物基因组,并能够在转录水平上表达。建立了检测植物褪黑素含量的反相高效液相色谱紫外检测（RP-HPLC）方法。色谱柱为SymmetryC18（150mmx4.6mm,5.0μm）;流动相为100mmol/L乙酸铵:甲醇体积比80:20,检测波长为265.8nm;灵敏度为2.00AUFS:流速为0.8mL·min-1时,褪黑素浓度在20～500ng·mL-1（R2=0.9992）范围内线性关系良好,平均加样回收率为98.09%（n=6）,RSD=2.21%,最小检出量为1.0ng·mL-1。褪黑素峰保留时间约为8min。通过RP-HPLC测定了烟草和贯叶连翘两种植物不同株系的转基因及其亲本（未转基因植株）的褪黑素含量,发现YXu55（含庆大霉素抗性标记和AANAT-HIOMT基因）转基因株系的褪黑素含量均高于pZP122（仅含庆大霉素抗性标记,不含AANAT-HIOMT基因的空白质粒）转基因株系和未转基因的对照植株;而pZP122转基因株系褪黑素含量跟未转基因的对照植株的含量几乎相等。用褪黑素含量明显提高的不同转基因植物株系,分析了植物抗氧化系统的变化,初步得知褪黑素合成过程中的关键酶AANAT-HIOMT基因的导入使植物提高了抗氧化能力。与空白质粒pZP122转化的植株和其亲本未转基因植株相比,转AANAT-HIOMT基因的两种植物株系的总抗氧化能力均明显提高（P＜0.05差异显著）,超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化物酶（POD）,过氧化氢酶（CAT）活性和谷胱甘肽（GSH）浓度也有所提高（P＞0.05差异不显著）;而丙二醛（MDA）含量并未因外源基因的导入而发生改变（P＞0.05差异不显著）。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.植物的遗传转化研究进展
• 1.1 遗传转化的受体选择
• 1.1.1 愈伤组织受体系统
• 1.1.2 直接分化受体系统
• 1.1.3 原生质体受体系统
• 1.1.4 种质受体系统
• 1.2 遗传转化的方法
• 1.2.1 农杆菌介导法
• 1.2.2 基因枪法
• 1.2.3 花粉管导入法
• 1.2.4 其它方法
• 1.3 转基因植物中的标记基因
• 1.3.1 植物遗传转化中常用的标记基因
• 1.3.2 标记基因的安全性问题
• 1.3.3 转基因作物中标记基因的消除
• 1.4 外源基因在转基因后代中的遗传行为
• 1.4.1 转基因植株的遗传行为
• 1.4.2 转基因沉默及对策
• 1.5 转基因植物的商业化生产
• 2.褪黑素的研究进展
• 2.1 褪黑素的生物化学性质
• 2.1.1 褪黑素的生物来源
• 2.1.2 褪黑素的合成与代谢
• 2.1.2.1 褪黑素的结构
• 2.1.2.2 褪黑素的合成
• 2.1.2.3 褪黑素的代谢
• 2.1.3 褪黑素含量的分析
• 2.2 褪黑素的生理功能及意义
• 2.2.1 褪黑素的作用机制—受体与信号转导途径
• 2.2.2 褪黑素的生理功能
• 2.2.3 褪黑素的应用
• 2.2.4 褪黑素应用的安全性
• 2.3 植物中的褪黑素的研究进展
• 2.3.1 植物中褪黑素的含量
• 2.3.2 植物中褪黑素合成
• 2.3.3 植物中褪黑素的功能
• 3.本研究的目的和意义
• 第二章 AANAT-HIOMT基因植物表达载体结构的验证
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 载体
• 1.1.3 试剂及试剂盒
• 1.1.4 主要试剂的配制
• 1.1.4.1 细菌培养用LB液体培养基
• 1.1.4.2 农杆菌培养用YEB液体培养基
• 1.1.4.3 常用抗生素的配制
• 1.1.4.4 大肠杆菌感受态溶液的配制
• 1.1.4.5 质粒DNA小量提取溶液的配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 农杆菌质粒DNA小量提取
• 1.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制作
• 1.2.3 大肠杆菌转化
• 1.2.4 转化子的鉴定
• 2.结果
• 2.1 pYXu55植物表达载体的验证
• 2.2 测序结果及质粒图谱修正
• 3.讨论
• 第三章 褪黑素合成酶基因对烟草（秦烟95）的遗传转化
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物转化载体
• 1.1.3 试剂及试剂盒
• 1.1.4 所需引物
• 1.1.5 主要试剂的配制
• 1.1.5.1 培养基配制
• 1.1.5.2 常用抗生素的配制
• 1.1.5.3 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 1.1.5.4 植物DNA提取溶液
• 1.1.5.5 Southern转移,杂交所需溶液
• 1.1.5.6 植物RNA提取溶液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 受体植物（秦烟95）无菌苗获得
• 1.2.2 秦烟95对庆大霉素的敏感性测定
• 1.2.3 含有YXu55和pZP122的农杆菌转化秦烟95及转化材料的培养
• 1.2.3.1 农杆菌菌株的培养
• 1.2.3.2 农杆菌感染
• 1.2.3.3 烟草转化材料的培养及筛选
• 1.2.3.4 假定烟草转基因苗的培养
• 1.2.3.5 烟草转基因苗的炼苗移栽
• 1.2.4 转基因烟草的鉴定
• 1.2.4.1 烟草基因组DNA的提取
• 1.2.4.2 转基因烟草的PCR检测
• 1.2.4.3 转基因烟草的Southern blot检测
• 1.2.4.4 转基因烟草的RT-PCR检测
• 2.结果与分析
• 2.1 农杆菌介导的AANAT-HIOMT基因对烟草的遗传转化
• 2.1.1 受体植物庆大霉素抗性浓度的确定
• 2.1.2 基因转化条件的确定
• 2.1.2.1 外植体预培养时间对转化效率的影响
• 2.1.2.2 农杆菌菌液浓度和浸染时间对转化的影响
• 2.1.3 转AANAT-HIOMT基因烟草的获得
• 2.2 转基因植株的分子生物学鉴定
• 2.2.1 转基因植物的PCR检测
• 2.2.2 转基因植物的Southern blot检测
• 2.2.3 转基因植物的RT-PCR检测
• 3.讨论
• 第四章 贯叶连翘离体再生体系的建立及转褪黑素合成酶基因再生植株的获得
• （一）.贯叶连翘离体再生体系的建立
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 无菌苗体系建立
• 1.2.2 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
• 1.2.3 不同激素组合对不定芽形成的影响
• 1.2.4 6-BA与NAA浓度对芽增殖的影响
• 1.2.5 不同激素组合对贯叶连翘再生根的影响
• 2.结果与分析
• 2.1 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
• 2.2 不同激素种类及配比对不定芽形成的影响
• 2.3 6-BA与NAA浓度对芽增殖的影响
• 2.4 不同激素组合对生根的影响
• 2.5 贯叶连翘的离体再生结果
• （二）.贯叶连翘的遗传转化和转基因植株的获得
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 试剂及试剂盒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 贯叶连翘对庆大霉素的敏感性测定
• 1.2.2 受体植物的培养及转化
• 1.2.2.1 农杆菌菌株的培养
• 1.2.2.2 农杆菌感染
• 1.2.2.3 贯叶连翘转化材料的培养及筛选
• 1.2.2.4 假定的贯叶连翘转基因苗的培养
• 1.2.2.5 贯叶连翘转基因苗的炼苗移栽
• 1.2.3 转基因贯叶连翘的分子生物学鉴定
• 2.结果与分析
• 2.1 农杆菌介导的AANAT-HIOMT基因对贯叶连翘的遗传转化
• 2.1.1 受体材料对庆大霉素的抗性
• 2.1.2 基因转化条件的确定
• 2.1.2.1 外植体预培养时间对转化效率的影响
• 2.1.2.2 农杆菌菌液浓度和浸染时间对转化的影响
• 2.1.3 转基因贯叶连翘的培养和筛选结果
• 2.2.转基因贯叶连翘的分子生物学鉴定
• 2.2.1 PCR检测
• 2.2.2 Southern blot检测
• 2.2.3 转基因贯叶连翘的RT-PCR检测
• （三）.本章讨论
• 第五章 RP-HPLC法测定转基因植株中褪黑激素含量
• 1.材料与方法
• 1.1 仪器、材料与试剂
• 1.2 溶液配制
• 1.2.1 供试溶液
• 1.2.2 对照品溶液
• 1.3 色谱条件
• 1.4 褪黑素测定HPLC线性关系
• 1.4.1 线性关系考察
• 1.4.2 样品最低检测量试验
• 1.4.3 干扰性试验
• 1.4.4 精密度实验
• 1.4.5 稳定性实验
• 1.4.6 重复性试验
• 1.4.7 加样回收率试验
• 1.5 样品的测定
• 2.结果与分析
• 2.1 色谱条件选择
• 2.2 褪黑素测定的HPLC线性关系
• 2.2.1 线性关系考察
• 2.2.2 样品最低检测量试验
• 2.2.3 干扰性试验
• 2.2.4 精密度实验结果
• 2.2.5 稳定性实验结果
• 2.2.6 重复性试验
• 2.2.7 加样回收率试验
• 2.3 样品的测定
• 3.讨论
• 第六章 转褪黑素合成酶基因植物的抗氧化系统变化
• 1.材料与方法
• 1.1 仪器、材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定
• 1.2.2 过氧化物酶（POD）的提取及活性测定
• 1.2.3 过氧化氢酶（CAT）的提取及活性测定
• 1.2.4 丙二醛（MDA）含量的测定
• 1.2.5 谷胱甘肽（GSH）含量的测定
• 1.2.6 总抗氧化能力的测定
• 1.2.7 统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 超氧化物歧化酶（SOD）的活性
• 2.2 过氧化物酶（POD）的活性
• 2.3 过氧化氢酶（CAT）的活性
• 2.4 丙二醛（MDA）含量变化
• 2.5 谷胱甘肽（GSH）含量变化
• 2.6 总抗氧化能力
• 3.讨论
• 论文主要结论、创新点与展望
• 参考文献
• 攻读博士期间的科研成果
• 致谢