黄瓜抗黑星病基因Ccu的精细定位与图位克隆及黄瓜与黑星菌互作的表达谱分析

论文摘要

黄瓜黑星病是黄瓜的主要病害之一，针对黄瓜抗黑星病基因的研究对明确黄瓜抗病机制和抗病育种都具有重要的意义。本研究以高感黑星病黄瓜材料9930 （中国华北保护地栽培品种）、高抗黑星病材料9110gt （欧洲温室品种）、Gy14 （美国加工品种）、Hardwickii （印度野生黄瓜）等为试材，对黄瓜全基因组水平NBS-encoding （Nucleotide banding site encoding）基因进行分析，对黄瓜抗黑星病基因进行遗传、定位和克隆研究，并对黄瓜与黑星病菌的亲和与不亲和互作进行研究，获得如下研究成果：1、全基因组水平分析发现9930、Gy14、Hardwikii中分别含有NBS-encoding基因58、60、60个，在基因组上的密度为20个/100 Mb基因组，为拟南芥、水稻、杨树等平均密度的1/5，且NBS结构内Kinase-2、Kinase-3、GLPL等保守域与其它几个物种相比，具明显的氨基酸不一致现象，LRR区域则高度保守。通过手工注释的方法发现三个黄瓜基因组中7个直系同源基因发生了移码突变、1个基因发生提前终止密码子突变、1个基因缺失突变，说明不同黄瓜品种中抗病基因差异大。2、精细定位了黄瓜抗黑星病基因Ccu，发现Ccu区域存在一个紧密连锁的抗病基因簇。利用148个株系的F9-RILs群体和2000个单株的F2群体为试材，采用分子标记、遗传连锁作图等技术将Ccu定位到黄瓜2号染色体短臂末端一个长度为140 kb的DNA区域，此区域包含一个紧密连锁的抗病基因簇，抗病基因簇中有三个基因呈串联相邻排列（Csa006756、Csa006757、Csa006758）。通过比较基因组学发现该抗病簇与甜瓜、拟南芥、杨树等同源区域具有共线性（图4-6、4-7）,表明此同源抗病基因簇由一个古老的抗病区域进化而来。3、图位克隆了Ccu候选基因。通过构建黄瓜抗黑星病品种9110gt BAC文库，筛选出包含目的抗病簇的BAC克隆H77-J7和H74-D1，进一步构建了长度为11 kb的亚克隆文库，筛选出包含候选基因起始密码子上游到终止密码子下游各约2.5 kb的目的亚克隆Csa00672756-1、Csa006757-1、Csa006758-1，可用于后续转基因验证其功能。4、通过黄瓜与黑星菌亲和与不亲和互作的表达谱分析，揭示了黄瓜抗黑星病的机制。以黄瓜高抗黑星病品种Gy14和高感黑星病品种9930为试材，利用高通量的测序技术对接种病菌材料及其对照材料进行表达谱分析，发现抗病品种在接种24小时后已全面上调了细胞内的2条HR（Hypersensitive Reaction）反应程序和1条PR （Pathogenesis related）基因相关的增强防御程序（图5-11、表5-5）中的编码关键因子基因。与抗病材料相比，感病材料中只部分启动了第三条WRKY转录因子参与的PR基因防御程序，其中WRKY转录因子表达水平显著上调，但其下游的PR基因却没有上调表达，植物未进入对病害的防御状态（图5-11、表5-5）。综上所述，本研究精细定位了黄瓜抗黑星病基因Ccu，并图位克隆了Ccu的候选基因，为黄瓜抗黑星病分子育种奠定了基础；表达谱分析明确了黄瓜抗黑星病的抗病机制，为黄瓜抗病研究提供了参考模式。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 植物抗病机制
• 1.1.1 植物固有内含物及结构对病害的抵抗机制
• 1.1.2 感染后诱导的植物对病害的抵抗机制
• 1.1.3 植物免疫系统
• 1.2 植物抗病基因特征
• 1.2.1 NBS-ENCODING基因的结构域
• 1.2.2 基因组水平NBS-LRR基因分析研究进展
• 1.3 黄瓜黑星病研究进展
• 1.4 基因的图位克隆
• 1.4.1 基因的精细定位与图位克隆
• 1.4.2 抗病基因的图位克隆进展
• 1.4.3 目前已经克隆到的NBS-encoding抗病基因
• 1.5 基因表达谱
• 1.5.1 表达谱技术
• 1.5.2 表达谱的应用
• 1.6 本研究的目的意义与技术路线
• 1.6.1 研究目的与意义
• 1.6.2 技术路线
• 第二章 黄瓜全基因组水平NBS-ENCODING抗病基因分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 黄瓜中NBS-encoding基因概况
• 2.2.2 黄瓜9930中NBS-encoding基因在黄瓜七条染色体上的分布
• 2.2.3 NBS-encoding基因的保守结构域分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 黄瓜全基因组NBS-encoding基因存在数目少的显著特点
• 2.3.2 黄瓜NBS-encoding基因结构及其与其它模式植物保守结构域的比较
• 2.3.3 三个黄瓜种中R基因的比较
• 第三章 黄瓜抗黑星病基因的精细定位
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 抗黑星病性状遗传分析
• 3.2.2 抗黑星病基因的初步定位
• 3.2.3 黄瓜抗黑星病基因精细定位标记的开发
• 3.2.4 黄瓜抗黑星病基因的精细定位
• 3.3 讨论
• 3.3.1 黄瓜抗黑星病基因区域
• 3.3.2 精细定位标记开发策略
• 3.3.3 黄瓜抗黑星病基因的精细定位
• 第四章 黄瓜CCU区域的分析与候选基因的图位克隆
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 黄瓜Ccu区域及三个黄瓜品种9930、Gy14、Hardwikii之间Ccu区域NBS-LRR直系同源基因之间的比较
• 4.2.2 黄瓜Ccu基因区域和一个包含抗病基因簇的甜瓜BAC序列具有共线性
• 4.2.3 Ccu区域NBS-encoding抗病基因簇与几个物种中同源抗病基因簇的比较
• 4.2.4 黄瓜品种9110gtBAC文库的构建及BAC克隆的筛选
• 4.2.5 包含候选Ccu基因的亚克隆文库构建
• 4.3 讨论
• 4.3.1 三个黄瓜种9110gt、gy14、9930中包含Ccu抗病基因簇比较
• 4.3.2 黄瓜Ccu基因区域由一个较古老的抗病基因簇进化而来
• 4.3.3 黄瓜9110gt材料BAC文库及亚克隆文库的构建
• 第五章 黄瓜与黑星菌互作表达谱分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 RNA测序前质量检测结果
• 5.2.2 序列质量评估
• 5.2.3 11个样品中差异表达基因的筛选
• 5.2.4 差异表达基因的Go分类分析
• 5.2.5 差异表达基因代谢途径（KEGG）分类分析：抗病品种Gy14在接种24小时内全面启动了抗病程序，而感病品种未启动抗病程序。
• 5.3 讨论
• 5.3.1 材料的选取及测序的质量
• 5.3.2 表达谱设计思路
• 5.3.3 五组样品的Go分类分析
• 5.3.4 通过KEGG分类找到Gy14抗病机制
• 第六章 全文总结
• 6.1 对黄瓜全基因组编码NBS-LRR结构抗病基因进行了分析，通过手工注释的方法找出了三个黄瓜种中NBS-LRR直系同源基因之间的差异。
• 6.2 精细定位了CCU基因，图位克隆了CCU的候选基因。
• 6.3 发现黄瓜CCU区域存在一个紧密连锁的古老的抗病基因簇。
• 6.4 黄瓜与黑星病菌的亲和与不亲和互作表达谱研究发现了黄瓜抗黑星病的抗病机制。
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 个人简历
• 博士期间发表文章