新型抗IgE人源化单克隆抗体的结构与功能研究

论文摘要

研究目的:I型超敏反应又称过敏反应,主要由特异性IgE抗体所介导,由于IgE处于变态反应炎症级联反应的最上游,在变态反应启动和发生过程中发挥着关键作用。1987年,首次提出应用抗IgE抗体治疗IgE介导的过敏性疾病,并描述了具有特异性结合能力的抗IgE单克隆抗体。1993年,Kolbinger等报道了一株鼠源性单抗（MaE11）的人源化过程,该抗体又称为Omalizumab或Xolair,包括大约5%的鼠源和95%的人源序列。2003年6月,美国FDA批准Xolair上市。上市伊始,2004年在美国的销售额即达到1.4亿美元,显示出良好的市场前景。然而Xolair抗体与IgE的亲和常数则仅有26nM左右,当抗IgE抗体的治疗浓度达到IgE基础水平的100倍时,才可结合99%的IgE分子,从而充分抑制IgE分子与FcεR相结合。在过敏性哮喘患者体内,游离IgE水平可升高数倍,Xolair抗体的临床用量需要根据IgE的基础水平进行调整,往往需要数百毫克才能达到治疗效果。因此,Xolair的治疗费用十分昂贵,即使在美国也受到医疗保险的限制,目前仅用于吸入激素无法控制的严重病例。国外也有其它医药公司研制了抗IgE的人源化抗体（瑞士Novartis、美国Tanox公司）,但由于其临床疗效尚不及Xolair,均于1996年终止了临床试验。本研究利用哺乳动物表达系统,制备了含有关键的功能表位的IgE片段（Fcε2-4）,通过杂交瘤技术制备新型的高亲和力抗IgE单克隆抗体,筛选具有竞争抑制IgE与其受体FcεR结合功能的克隆。为降低鼠源单抗的免疫原性,对筛选获得的抗体进行人源化改造,比较制备所获抗体及Xolair与IgE结合的亲和力及体外功能,以期从结构上阐明该抗体的作用机制。通过该课题的研究,以期获得亲和力更高的、可望用于过敏性疾病预防和治疗的新型抗IgE人源化单克隆抗体。研究方法:本课题采用小鼠杂交瘤技术,利用IgE Fcε2-4作为免疫原,免疫获得具有竞争抑制IgE与FcεR结合功能的鼠源单克隆抗体。为进一步降低单抗的免疫原性,减轻用于人体时的HAMA反应,提高安全性,我们采用计算机辅助设计模拟抗体空间构象的方法,对鼠源抗体进行了人源化改造,对改造成功的人源化单克隆抗体体外功能进行了详细分析,并与Omalizumab的体外功能进行比较。我们应用噬菌体随机七肽库对人源化单克隆抗体的抗原表位进行亲和淘选,从而明确抗体识别的表位,通过分析IgE与其高亲和力受体FcεRIα的复合物结晶,与抗IgE抗体所识别表位进行比较,从空间结构上解释和阐明抗IgE人源化单克隆抗体的功能学基础。结果:获得哺乳动物细胞表达的IgE Fcε2-4以及FcεRIA,通过杂交瘤技术筛选获得具有竞争抑制IgE与FcεR结合的鼠源抗IgE单克隆抗体7A5。利用计算机辅助设计的手段,改造获得亲和力和特异性均较好的人源化抗IgE体Hu7A5m18。体外功能分析结果表明:Hu7A5m18可抑制IgE与可溶性及细胞表面FcεRI结合,而对结合于细胞表面FcεRI的IgE则无影响,Hu7A5m18可以抑制IgE与细胞表面FcεRI结合导致的脱颗粒反应。Hu7A5m18介导上述体外功能的EC50仅为Omalizumab的1/10左右。SPR技术检测M7A5、Hu7A5m18及Omalizumab与IgE的亲和力分别为1.9nM、1.7nM和23.8nM,因此Hu7A5m18人源化改造成功,而且该单抗的亲和力明显高于Omalizumab。我们应用噬菌体随机七肽库对Hu7A5m18的抗原表位进行亲和淘选,通过对阳性噬菌体序列的分析比对,发现一个非常保守的序列被高度扩增,而这个序列与IgE恒定区Cε3片段内的391KQR393高度同源。通过分析IgE与其高亲和力受体FcεRIα的复合物结晶,发现IgE恒定区Cε3片段内的391KQR393序列在空间上临近IgE高亲和力受体FcεRIα在IgE分子上的结合位点,从而推论正是由于这种结合位点上的空间位置,使Hu7A5m18可以通过空间位阻抑制IgE分子同高亲和力受体FcεRIα结合。我们前期的研究结果显示,Omalizumab识别表位定位于IgE-Fc Cε3的424HLP426,该序列与高亲和力IgE受体结合位点重叠。由于Hu7A5m18识别表位391KQR393在空间上与Omalizumab识别表位424HLP426也临近,这也正是Hu7A5m18能够与Omalizumab竞争结合IgE的结构原因。结论:本研究制备的新型抗IgE人源化单克隆抗体,具有更好的亲和力以及体外功能,可望解决目前临床应用的IgE抗体活性不高,用量过大的瓶颈,成为过敏性疾病预防和治疗的候选药物。表位淘选获得该抗体识别的新的功能性表位391KQR393,由于其与Omalizumab识别表位424HLP426在空间上的接近,因此Hu7A5m18可以更有效的抑制IgE与靶细胞的结合而导致的脱颗粒反应,从而减轻过敏反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 抗IgE 单克隆抗体的制备
• 一、材料
• （一） 细胞株、菌株、实验动物
• （二） 试剂
• （三） 主要仪器设备
• 二、方法
• （一） IgE Fcε2-4 表达载体的构建
• （二） IgE Fc 高亲和力受体FcεRIA 胞外区表达载体的构建
• （三） 蛋白表达、纯化和理化性质鉴定
• （四） 杂交瘤制备
• （五） 抗IgE 单克隆抗体的人源化
• 三、结果
• （一） IgE Fcε2-4 及IgE FcεRIA 的构建、表达及鉴定
• （二） 抗IgE Fc 单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
• （三） 抗IgE 鼠源单抗7A5 的人源化改造
• 四、讨论
• 第二部分 抗IgE 人源化单抗Hu7A5m18 的功能研究
• 一、材料
• （一） 重组蛋白、抗体及细胞系
• （二） 试剂
• （三） 主要仪器设备
• 二、方法
• （一） Hu7A5m18 抑制IgE 与可溶性FcεRI 的结合实验
• （二） Hu7A5m18 抑制IgE 与细胞表面FcεRI 的结合实验
• （三） Hu7A5m18 与结合于细胞表面FcεRI 的IgE 的结合实验
• （四） Hu7A5m18 抑制IgE 引起脱颗粒的功能学实验
• 三、结果
• （一） Hu7A5m18 抑制IgE 与可溶性FcεRI 结合
• （二） Hu7A5m18 抑制IgE 与细胞表面FcεRI 结合
• （三） Hu7A5m18 不与结合于细胞表面FcεRI 的IgE 的结合
• （四） Hu7A5m18 抑制IgE 导致的脱颗粒
• 四、讨论
• 第三部分 抗IgE 人源化单抗Hu7A5m18 的结构研究
• 一、材料
• （一） 菌株、噬菌体随机文库及抗体
• （二） 试剂配制
• （三） 实验设备、器材
• 二、方法
• （一） 噬菌体随机肽库筛选Hu7A5m18 抗原表位
• （二） Hu7A5m18 抗原表位的鉴定
• 三、结果
• （一） 噬菌体随机肽库筛选Hu7A5m18 抗原表位
• （二） Hu7A5m18 抗原表位的鉴定
• 四、讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 致谢