利用单根肌纤维法分离和培养猪骨骼肌卫星细胞及其成肌诱导分化研究

论文摘要

骨骼肌是由终末分化的多核肌纤维组成。因此,出生后骨骼肌的再生取决于未分化的单核肌肉祖细胞库,而卫星细胞是这个库的主要成分。卫星细胞是一种位于肌纤维膜表面与基底膜之间的,呈静息态的肌源性干细胞,具有增殖和成肌分化潜能,对骨骼肌内环境的稳定、肌纤维的肥大和损伤修复起着重要作用。在形态学上,它们呈梭形或卵圆形,具有高核质比和细胞器内含物少的特点。但是,谁来调控卫星细胞的自我更新或分化的认识才刚刚开始,目前认为静息期的卫星细胞表达Pax7转录因子,当它被激活后,同时表达Pax7和MyoD。当增殖完成后,大多数卫星细胞下调Pax7表达,同时进行分化。其它的子代卫星细胞仍然维持Pax7的表达但不表达MyoD,退出细胞周期重新回到静息状态。单根肌纤维的分离,培养已经广泛用于研究卫星细胞基因的表达、成肌发育和肌肉再生过程中。由于分离,培养单根肌纤维消除了非肌肉细胞的影响,并维持了其静息状态,所以它的作用是非常强大的,而国内还尚未见报道。因此,本研究通过Ⅰ型胶原酶消化,从猪骨骼肌中分离完整的单根肌纤维并培养,用细胞免疫荧光鉴定肌纤维上的卫星细胞,随后对从单根肌纤维上游离出来的卫星细胞进行细胞免疫荧光染色,传代培养,生长曲线绘制,成肌诱导分化和Western blot分析骨骼肌卫星细胞成肌特异性蛋白的表达。其主要研究结果如下:1.分离并培养的单根肌纤维上附着有卵圆形的细胞,并随时间的推移,细胞缓慢向外迁移并增殖,卫星细胞特异性标志基因Pax7和MyoD免疫荧光染色呈阳性,且阳性率达到90%以上。2.在增殖培养基中添加1%的鸡胚提取物可以显著的促进骨骼肌卫星细胞的增殖;于不同时期,WB分析猪骨骼肌卫星细胞特异性蛋白表达发现,MyoD蛋白高表达于增殖期,而Myogenin和MyHC在进入分化期才表达。3.在成肌诱导分化中,与用传统的DMⅠ分化培养基培养比较,DMⅡ分化培养基更利于细胞汇合,分化形成多核肌管,且成肌特异性标志基因Myogenin、MyHC表达量显著上调。综上所述:该研究成功建立了猪骨骼肌单根肌纤维的体外培养方法并获得了高纯度的卫星细胞;其次,优化了猪骨骼肌卫星细胞的增殖、分化培养体系;最后,初步分析了猪骨骼肌卫星细胞中成肌特异性蛋白表达规律,为今后骨骼肌卫星细胞的迁移、增殖和分化机理研究提供了理想的实验材料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 出生后骨骼肌再生机制概述
• 1.1 骨骼肌发育的一般原理
• 1.2 哺乳动物出生后骨骼肌的再生机制
• 第二章 骨骼肌卫星细胞的生物学特性
• 2.1 骨骼肌卫星细胞的起源
• 2.2 骨骼肌卫星细胞的激活
• 2.3 骨骼肌卫星细胞的自我更新和干细胞潜能
• 2.4 骨骼肌卫星细胞的增殖与分化的分子调节机制
• 2.4.1 骨骼肌卫星细胞增殖的分子调节机制
• 2.4.2 骨骼肌卫星细胞分化的分子调节机制
• 第三章 骨骼肌卫星细胞体外培养方法的研究进展
• 3.1 骨骼肌卫星细胞体外培养的方法
• 3.1.1 差速贴壁法
• 3.1.2 密度梯度离心法
• 3.1.3 单根肌纤维法
• 3.2 骨骼肌卫星细胞的鉴定
• 3.2.1 形态学鉴定
• 3.2.2 成肌特异性蛋白
• 3.3 单根肌纤维法分离、培养骨骼肌卫星细胞的影响因素
• 3.3.1 微环境
• 3.3.2 血清
• 3.3.3 生长因子
• 3.3.4 实验动物及骨骼肌种类
• 实验研究
• 前言
• 第四章 单根肌纤维的分离和培养
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要试剂及其配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 培养皿的预处理
• 4.2.2 EDL 的分离
• 4.2.3 EDL 的消化
• 4.2.4 单根肌纤维的培养
• 4.2.5 免疫荧光染色
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 猪骨骼肌纤维的形态特征
• 4.3.2 单根肌纤维的培养
• 4.3.3 猪骨骼肌纤维上卫星细胞的鉴定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 猪骨骼肌卫星细胞的鉴定、传代培养和增殖研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 主要试剂及其配置
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 去除单根骨骼肌纤维
• 5.2.2 传代培养猪骨骼肌卫星细胞
• 5.2.3 骨骼肌卫星细胞的鉴定
• 5.2.4 总RNA 提取
• 5.2.5 PCR 扩增
• 5.2.6 骨骼肌卫星细胞的纯度检测
• 5.2.7 绘制骨骼肌卫星细胞的生长曲线
• 5.2.8 鸡胚提取物对骨骼肌卫星细胞增殖的影响
• 5.2.9 Western blotting 检测
• 5.2.10 数据分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 猪骨骼肌卫星细胞的形态学观察
• 5.3.2 猪骨骼肌卫星细胞的鉴定
• 5.3.3 猪骨骼肌卫星细胞的纯度检测
• 5.3.4 猪骨骼肌卫星细胞的生长曲线绘制
• 5.3.5 猪骨骼肌卫星细胞的传代培养
• 5.3.6 CEE 对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响
• 5.3.7 RT-PCR 检测成肌特异性基因的表达
• 5.3.8 Western blot 检测成肌特异性蛋白的表达
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 不同培养体系对猪骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响
• 6.1 材料
• 6.1.1 实验动物
• 6.1.2 主要试剂及其配备
• 6.1.3 主要仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 培养皿的预处理
• 6.2.2 传代培养猪骨骼肌卫星细胞
• 6.2.3 猪骨骼肌卫星细胞的成肌诱导分化
• 6.2.4 免疫荧光染色
• 6.2.5 Western blot 检测
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 不同培养体系处理对猪骨骼肌卫星细胞形态的影响
• 6.3.2 免疫荧光染色分析不同培养体系下猪骨骼肌卫星细胞的分化水平
• 6.3.3 不同培养体系下猪骨骼肌卫星细胞成肌分化标记蛋白的表达变化
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 结论
• 创新点
• 进一步研究内容
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介