不同真菌来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达

论文摘要

ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase, ACL, EC 2.3.3.8）是脂肪酸合成途径外的一个关键酶,它能催化柠檬酸裂解成草酰乙酸和乙酰辅酶A。ACL的存在是微生物油脂积累的一个先决条件,本研究利用基因组步移法和常规PCR法从5种不同的真菌：粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、斯达酵母（Lipomyces starkeyi）、高山被孢霉（Mortieralla alpine）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）中分别克隆得到了acl基因,并分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行了异源表达,然后通过紫外分光光度计法测定酶活和气相色谱分析测定脂肪酸含量的方法来对表达产物进行功能验证。主要结果如下：（1）成功克隆得到了5种真菌来源的acl基因,其中利用基因组步移法克隆得到了在GenBank中未登录的粘红酵母和斯达酵母的acl基因编码序列,且这两种菌的acl基因序列完全一致,包含有两个亚基acll（1953 bp）和acl2（1494 bp）。（2）成功将5种真菌来源的acl基因在大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）进行了诱导表达,SDS-PAGE检测表明粘红酵母、斯达酵母、米曲霉和核盘菌的来源的acl基因表达后的ACL1和ACL2亚基的分子量大小都相似,分别约为66 kDa和55 kDa,高山被孢霉来源的acl基因表达后的ACL蛋白分子量大小约为120 kDa。（3）对所有大肠杆菌表达后的ACL蛋白酶活力进行了测定,结果表明粘红酵母、斯达酵母的acl基因表达后具有最高的酶活力（4.2U/mg）,且只有当ACL1和ACL2亚基都具备,摩尔比为1：1时才能使全酶的酶活力达到最大。（4）将粘红酵母acll和acl2基因在大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）中进行共表达,气相色谱分析脂肪酸含量,结果表明重组菌株在诱导表达12h时脂肪酸含量达到最大,为8.2%,较对照菌株的提高量也达到最大的24.8%,提高效果十分显著。（5）对粘红酵母acll和acl2基因在毕赤酵母GS115进行表达研究,结果表明表达后全酶的酶活力为6.5U/mg,较原核表达的酶活力提高了近55%,并确定了酶催化反应的最佳条件为：pH8.5,37℃反应10min。本研究表明粘红酵母和斯达酵母等油脂酵母类的acl基因可以利用基因工程手段对其表达量进行调控,提高ACL酶活力,增强脂肪酸的合成。因此,油脂酵母可提供新的acl基因资源,并应用于后续的转基因植物,提高油料作物的油脂含量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物油脂的现状
• 1.2 产油微生物的种类
• 1.2.1 酵母菌和霉菌
• 1.2.2 藻类
• 1.2.3 细菌
• 1.3 生物油脂代谢的途径和进展
• 1.4 ATP-柠檬酸裂解酶的作用机制
• 1.5 ATP-柠檬酸裂解酶的研究进展
• 1.6 基因表达系统
• 1.6.1 大肠杆菌表达系统
• 1.6.2 酵母表达系统
• 1.7 本课题研究意义
• 第二章 不同真菌来源acl基因的克隆
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要仪器设备
• 2.2.2 菌株和质粒
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要试剂溶液的配制
• 2.2.4.1 培养基及相关试剂
• 2.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳相关试剂
• 2.2.4.3 质粒提取及相关溶液
• 2.2.5 所需引物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 粘红酵母和斯达酵母中acl基因的克隆
• 2.3.1.1 DNA和RNA的提取
• 2.3.1.2 简并引物的设计
• 2.3.1.3 acl基因保守区的扩增
• 2.3.1.4 大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备
• 2.3.1.5 转化
• 2.3.1.6 阳性克隆子的筛选
• 2.3.1.7 基因组步移法扩增acl基因全长
• 2.3.1.8 RT-PCR扩增acl基因全长
• 2.3.2 高山被孢霉、米曲霉和核盘菌acl基因的克隆
• 2.3.2.1 DNA的提取
• 2.3.2.2 引物设计
• 2.3.2.3 acl基因的扩增
• 2.3.2.4 序列测序
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 DNA和RNA的提取
• 2.4.2 粘红酵母和斯达酵母acl基因的克隆
• 2.4.2.1 acl基因保守区的扩增
• 2.4.2.2 基因组步移法扩增结果
• 2.4.2.3 RT-PCR扩增结果
• 2.4.2.4 序列分析
• 2.4.3 高山被孢霉、米曲霉和核盘菌acl基因的克隆
• 2.5 讨论
• 2.5.1 真菌DNA的提取
• 2.5.2 利用CODEHOP方法设计简并引物
• 2.5.3 acl基因序列的分析
• 2.6 本章小结
• 第三章 不同真菌来源acl基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要仪器设备
• 3.2.2 菌株和质粒
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要试剂溶液的配制
• 3.2.4.1 蛋白纯化缓冲液
• 3.2.4.2 Tris-cine系统电泳缓冲液
• 3.2.4.3 脂肪酸分析试剂
• 3.2.5 所需引物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 不同真菌来源acl基因在大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）中的表达
• 3.3.1.1 引物设计
• 3.3.1.2 acl1和acl2基因的扩增
• 3.3.1.3 限制性内切酶消化DNA片段和表达质粒
• 3.3.1.4 DNA片段的连接
• 3.3.1.5 转化大肠杆菌DH5α
• 3.3.1.6 阳性克隆子的筛选
• 3.3.1.7 重组质粒的抽提和酶切鉴定
• 3.3.1.8 表达宿主菌的转化和目的蛋白的诱导表达
• 3.3.1.9 ACL蛋白的纯化
• 3.3.1.10 ACL蛋白酶活测定
• 3.3.2 粘红酵母acl1和acl2基因在大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）中的共表达
• 3.3.2.1 引物设计
• 3.3.2.2 重组质粒构建
• 3.3.2.3 重组质粒的大量提取
• 3.3.2.4 表达宿主菌的转化和目的蛋白的诱导表达
• 3.3.2.5 重组菌株脂肪酸含量的测定
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 不同真菌来源acl基因在大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）中的表达
• 3.4.1.1 重组载体构建图谱
• 3.4.1.2 重组载体验证
• 3.4.1.3 ACL1和ACL2诱导表达条件的优化
• 3.4.1.4 ACL蛋白的纯化
• 3.4.1.5 ACL蛋白的酶活测定
• 3.4.2 粘红酵母acl1和acl2基因在大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）中的共表达
• 3.4.2.1 重组载体构建图谱
• 3.4.2.2 重组质粒验证
• 3.4.2.3 ACL蛋白共表达SDS-PAGE分析
• 3.4.2.4 脂肪酸含量分析结果
• 3.5 讨论
• 3.5.1 原核表达系统
• 3.5.1.1 表达载体和宿主菌的影响
• 3.5.1.2 表达产物的形式
• 3.5.2 蛋白纯化
• 3.5.3 不同菌株来源acl基因的原核表达后的酶活力比较
• 3.6 本章小结
• 第四章 粘红酵母acl1和acl2基因在毕赤酵母中的表达
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 主要仪器设备
• 4.2.2 菌株和质粒
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要试剂溶液的配制
• 4.2.4.1 储存液的配制
• 4.2.4.2 酵母培养基的配制
• 4.2.5 所需引物
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 引物设计
• 4.3.2 重组质粒构建
• 4.3.3 重组质粒的大量提取
• 4.3.4 电转化
• 4.3.4.1 毕赤酵母GS115感受态的制备
• 4.3.4.2 质粒线性化
• 4.3.4.3 电转化
• 4.3.5 酵母重组子的筛选
• 4.3.6 ACL蛋白的小量诱导表达
• 4.3.7 ACL蛋白的纯化
• 4.3.8 ACL蛋白的体外酶学性质的研究
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 重组质粒构建
• 4.4.1.1 重组载体构建图谱
• 4.4.1.2 重组载体双酶切验证
• 4.4.2 ACL蛋白的表达和纯化
• 4.4.3 重组ACL蛋白酶学性质的研究
• 4.4.3.1 重组ACL蛋白的酶比活力的测定
• 4.4.3.2 重组ACL蛋白酶最适反应条件的优化
• 4.5 讨论
• 4.5.1 宿主菌和表达载体
• 4.5.2 ACL蛋白降解问题
• 4.5.3 ACL蛋白毕赤酵母表达后的酶活
• 4.6 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录