细胞外HSP70对类风湿关节炎的抗炎作用及机制研究

论文摘要

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以累及周围关节为主要表现的系统性炎症性自身免疫病。其病理特征表现为关节滑膜面的炎症及滑膜组织的增生导致关节腔的损伤和关节的破坏。尽管RA的发病机制迄今仍未完全阐明,但细胞因子网络在RA的滑膜炎症及骨质破坏中起到重要作用,是使RA病变持续存在、迁延进展的关键因素。热休克蛋白（heat shock protein,HSP）是一高度保守的应激蛋白家族,广泛存在于原核细胞和真核细胞中。HSP70是热休克蛋白家族中最重要的成员,其基本功能是参与新生蛋白质的折叠、解聚、移位等,故有“分子伴侣”（molecular chaperone）之称。长期以来,热休克蛋白被认为是细胞内的蛋白质,只能在细胞内发挥功能。近年研究发现,HSP70能被释放到细胞外环境中,称为细胞外HSP70（extracellular HSP70）;而且细胞外HSP70可能作为免疫系统的“危险信号”,调节免疫细胞的功能,参与免疫性疾病的病理过程。近年来研究发现,RA患者关节液中HSP70水平明显升高。然而,RA关节液和血清中HSP70与RA活动性之间相关性如何?关节液中HSP70的来源和释放机制是什么?细胞外HSP70对RA炎症是否有影响?目前尚无相关研究。本研究首先观察了RA患者血清和关节液中HSP70水平的改变及其临床意义;然后探讨热应激和TNF-α对细胞外HSP70释放的影响及其机制;并从整体动物水平和细胞水平探讨细胞外HSP70对RA的作用及其机制。主要的实验结果如下:1、RA患者血清和关节液中HSP70的改变及临床意义。（1）类风湿关节炎（RA）患者血清中HSP70含量变化:RA患者血清中HSP70含量（2.84±1.16 ng/ml）明显高于骨关节炎（OA）（0.74±0.34 ng/ml）和正常对照组（0.84±0.42 ng/ml）,并且活动期RA血清中HSP70含量（3.31±1.09 ng/ml）明显高于非活动期RA（1.89±0.06 ng/ml）;RA患者血清中HSP70水平与肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6水平呈正相关;RA患者血清HSP70的水平与血沉（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）呈正相关。（2）类风湿关节炎（RA）患者关节液中HSP70含量变化:RA患者关节液中HSP70含量（88.97±21.49 ng/ml）明显高于OA组（33.13±17.27 ng/ml）,并且活动期RA（102.55±19.61 ng/ml）明显高于非活动期RA（80.36±10.88 ng/ml）;RA患者血清HSP70水平与TNF-α、IL-6、IL-10水平呈正相关。上述结果提示细胞外HSP70产生可能与RA炎症刺激有关,也提示细胞外HSP70可能参与RA的炎症过程,细胞外HSP70水平可以考虑作为RA患者的病情活动指标。2、应激对成纤维样滑膜细胞HSP70释放的影响。（1）热应激对HSP70释放的影响:成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLSs）遭受不同温度的热休克（heat shock,HS）时,细胞内HSP70表达和细胞外HSP70释放都明显增加;重度HS引起HSP70释放增多同时伴有乳酸脱氢酶（LDH）释放增多;轻度HS也能诱导HSP70释放,却没有明显LDH释放。（2）炎症应激对HSP70释放的影响:TNF-α能剂量和时间依赖性诱导成纤维样滑膜细胞HSP70的表达和释放增多,但是LDH释放并没有明显增多。这提示多种应激可导致HSP70的主动释放。（3）脂筏在HSP70主动释放中的作用:脂筏结构的破坏剂β甲基环状糊精（methyl-β-cyclodextrin,MβD）处理成纤维样滑膜细胞后能上调热休克和TNF-α诱导的细胞内HSP70表达水平,同时MβD能剂量依赖性抑制热休克或TNF-α所致成纤维样滑膜细胞HSP70的主动释放。以上研究表明,各种应激刺激,包括TNF-α能促进成纤维样滑膜细胞HSP70的表达和主动释放,而脂筏与成纤维样滑膜细胞HSP70的主动释放有关。3、HSP70对成纤维样滑膜细胞炎症细胞因子分泌的影响及机制。（1）细胞外HSP70对成纤维样滑膜细胞炎症细胞因子分泌的影响:本研究用重组的人HSP70处理成纤维样滑膜细胞,结果发现HSP70单独处理不能影响促炎因子IL-6、IL-8和巨噬细胞趋化蛋白（MCP）-1的分泌,但能剂量依赖性抑制TNF-α所致成纤维样滑膜细胞中IL-6、IL-8和MCP-1的分泌;HSP70能剂量和时间依赖性直接诱导抗炎细胞因子IL-10的生成;煮沸（100℃）能消除HSP70对细胞因子分泌的影响,而多粘菌素B（polymyxin B,PMB）不能消除HSP70对细胞因子分泌的影响。以上结果表明细胞外HSP70通过抑制成纤维样滑膜细胞促炎因子分泌和促进抗炎因子分泌而发挥抗炎作用,而且细胞外HSP70对细胞因子分泌的影响与内毒素污染无关。（2）HSP70作用于成纤维样滑膜细胞的受体类型:本研究首先通过RT-PCR和Western blotting实验证实了Toll样受体（toll-likereceptor,TLR）2和TLR4在成纤维样滑膜细胞中的表达;采用专一针对抗TLR2或TLR4的单克隆抗体封闭成纤维样滑膜细胞膜上TLR2或TLR4,发现抗TLR4抗体预处理废除了HSP70对促炎细胞因子IL-6、IL-8、MCP-1和抗炎细胞因子IL-10分泌的影响,而抗TLR2抗体预处理却不能废除HSP70对上述细胞因子分泌的影响。以上结果表明细胞外HSP70对成纤维样滑膜细胞炎症因子分泌的影响是TLR4依赖性的,即成纤维样滑膜细胞表面TLR4可能是细胞外HSP70的受体。（3）HSP70对炎症信号通路的影响:重组的人HSP70能够显著抑制TNF-α所致JNK、ERK、p38 MAPK的活化;HSP70能够抑制TNF-α所致IκB的降解和NF-κB p65的核移位;HSP70也能够直接诱导STAT3的活化和SOCS3的表达。上述研究表明,细胞外HSP70通过抑制MAPK、NF-κB通路的活化及激活JAK-STAT3-SOCS3通路来调节炎症细胞因子分泌。4、HSP70对胶原性关节炎（collagen induced arthritis,CIA）动物模型的影响。本研究首先应用基因工程技术制备重组的人HSP70,然后在小鼠初次免疫胶原后的第28天出现关节炎时给予重组HSP70腹腔注射。结果显示,HSP70能够减轻CIA小鼠关节肿胀和降低关节炎评分;组织病理学检查显示HSP70能够减少滑膜组织炎症细胞渗出和骨质破坏。此外,HSP70明显降低CIA小鼠血清中TNF-α和IL-6水平。上述研究表明细胞外HSP70能够缓解小鼠胶原性关节炎的炎症,对RA具有治疗作用。综上所述,RA患者血清和关节液中HSP70水平明显升高,并且与RA疾病活动性和炎症细胞因子之间存在相关性,提示细胞外HSP70产生可能与RA炎症刺激有关,细胞外HSP70水平可作为RA疾病活动性的参考指标;热休克或TNF-α诱导了成纤维样滑膜细胞HSP70的主动释放,而且HSP70的主动释放与成纤维样滑膜细胞膜上的脂筏结构有关,提示RA患者关节液中高水平的HSP70可能来源于成纤维样滑膜细胞受应激刺激后的主动分泌;重组人HSP70通过抑制成纤维样滑膜细胞促炎因子IL-6、IL-8和MCP-1的分泌和促进抗炎细胞因子IL-10分泌来发挥抗炎作用;HSP70对细胞因子分泌的影响具有TLR4依赖性,提示成纤维样滑膜细胞表面的TLR4可能是HSP70作用的受体;HSP70通过抑制MAPK、NF-κB通路和激活JAK-STAT3-SOCS3通路来调节成纤维样滑膜细胞炎症因子的分泌;重组HSP70减轻CIA小鼠关节肿胀,抑制滑膜组织炎症细胞渗出和骨质破坏,降低血清促炎因子的水平,从而能有效缓解CIA小鼠病情恶化,对RA具有治疗作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写注释
• 前言
• 第一章 RA患者血清和关节液中HSP70的改变及临床意义
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂和试剂盒
• 1.1.2.主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 临床对象及分组
• 1.2.2 临床标本采集和处理
• 1.2.3 HSP70含量测定
• 1.2.4 细胞因子含量测定
• 1.2.5 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 类风湿关节炎患者血清HSP70含量变化
• 2.1.1 类风湿关节炎组、骨关节炎组及正常对照组血清HSP70含量比较
• 2.1.2 活动期类风湿关节炎和非活动期类风湿关节炎血清HSP70含量比较
• 2.1.3 类风湿关节炎患者血清HSP70含量与RA活动性相关指标的相关性分析
• 2.1.4 类风湿关节炎患者血清HSP70含量与血清TNF-α、IL-6、IL-10含量的相关性分析
• 2.2 类风湿关节炎患者关节液HSP70含量变化
• 2.2.1 类风湿关节炎组和骨关节炎组关节液中HSP70含量比较
• 2.2.2 活动期类风湿关节炎和非活动期类风湿关节炎关节液中HSP70含量比较
• 2.2.3 类风湿关节炎患者关节液HSP70含量与关节液TNF-α、IL-6、IL-10含量的相关性分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 应激对HSP70表达和释放的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂及试剂盒
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 人成纤维样滑膜细胞的分离和培养
• 1.2.2 热休克模型制作
• 1.2.3 细胞总蛋白的提取
• 1.2.4 蛋白质浓度的测定
• 1.2.5 Western blotting分析
• 1.2.6 细胞培养基中HSP70含量测定
• 1.2.7 乳酸脱氢酶（LDH）释放率检测
• 1.2.8 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 热休克对成纤维样滑膜细胞HSP70表达和释放的影响
• 2.2 TNF-α对成纤维样滑膜细胞HSP70表达和释放的影响
• 2.3 脂筏对成纤维细胞样滑膜HSP70表达和释放的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 HSP70对成纤维样滑膜细胞炎症细胞因子分泌的影响及机制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂及试剂盒
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 人成纤维样滑膜细胞的分离和培养
• 1.2.2 细胞总蛋白的提取
• 1.2.3 细胞核蛋白和胞浆组分的分离
• 1.2.4 蛋白质浓度的测定
• 1.2.5 Western blotting分析
• 1.2.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）
• 1.2.7 细胞免疫荧光分析
• 1.2.8 RT-PCR分析
• 1.2.9 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 HSP70对成纤维样滑膜细胞促炎介质IL-6、IL-8和MCP-1分泌的影响
• 2.1.1 HSP70与TNF-α单独刺激对成纤维样滑膜细胞IL-6、IL-8和MCP-1分泌的影响
• 2.1.2 HSP70对TNF-α诱导的成纤维样滑膜细胞IL-6、IL-8和MCP-1分泌的影响
• 2.1.3 重组HSP70中可能的内毒素污染对成纤维样滑膜细胞IL-6、IL-8和MCP-1分泌的影响
• 2.2 HSP70对成纤维样滑膜细胞抗炎细胞因子IL-10分泌的影响
• 2.2.1 HSP70直接促进成纤维样滑膜细胞中IL-10的分泌
• 2.2.2 HSP70中内毒素污染对成纤维样滑膜细胞IL-10分泌的影响
• 2.3 HSP70对成纤维样滑膜细胞炎症细胞因子分泌的影响具有TLR4依赖性
• 2.3.1 成纤维样滑膜细胞中TLR2和TLR4的表达
• 2.3.2 TLR4介导了HSP70对成纤维样滑膜细胞中IL-6、IL-8和MCP-1分泌的抑制
• 2.3.3 TLR4介导了HSP70对成纤维样滑膜细胞中IL-10分泌的影响
• 2.4 HSP70对成纤维样滑膜细胞MAPK信号通路活化的影响
• 2.4.1 TNF-α对成纤维样滑膜细胞MAPK信号通路的活化
• 2.4.2 HSP70对TNF-α诱导的成纤维样滑膜细胞MAPK信号通路活化的影响
• 2.5 HSP70对成纤维样滑膜细胞NF-κB信号通路活化的影响
• 2.5.1 TNF-α对成纤维样滑膜细胞NF-κB信号通路的活化
• 2.5.2 HSP70对TNF-α诱导的NF-κB（P65）核移位的影响
• 2.5.3 HSP70对TNF-α所致IκBα降解的影响
• 2.6 HSP70对成纤维样滑膜细胞JAK2-STAT3-SOCS3信号通路直接的活化作用
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 HSP70对胶原诱导性关节炎动物模型的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 动物
• 1.1.2 质粒和菌株
• 1.1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组人HSP70蛋白的制备
• 1.2.1.1 重组HSP70的表达和分离纯化
• 1.2.1.2 重组HSP70中内毒素的去除和检测
• 1.2.1.3 重组HSP70浓度的测定
• 1.2.1.4 重组HSP70纯度的鉴定
• 1.2.2 胶原性关节炎动物模型的建立
• 1.2.2.1 Ⅱ型胶原乳化液的制备
• 1.2.2.2 造模方法
• 1.2.3 动物分组、给药方法及取材方法
• 1.2.4 关节炎评价方法
• 1.2.4.1 关节炎评分
• 1.2.4.2 组织病理学评分
• 1.2.4.3 血清TNF-α、IL-6含量测定
• 1.2.5 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 重组人HSP70在大肠杆菌的表达、纯化和鉴定
• 2.2 HSP70对胶原诱导性关节炎小鼠关节炎症的影响
• 2.3 HSP70对胶原诱导性关节炎小鼠组织病理学改变的影响
• 2.4 HSP70对胶原诱导性关节炎小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 总结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要成果