论文摘要
研究背景：生物治疗是目前肿瘤治疗的热点领域,不仅受到基础研究领域的重视,更得到转化医学科学家及临床医生的关注。生物治疗不仅是传统治疗手段的补充,更是治疗观念的更新,但其临床应用的安全性和有效性问题,仍是制约着肿瘤生物治疗发展的两大关键。现阶段处于研究前沿的一种肿瘤生物治疗方法是基于T细胞的肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes, TIL）过继免疫细胞治疗（Adoptive Cell Therapy / Adoptive Cell Transfer Treatment, ACT）。同时,肿瘤的一大生物学特征——免疫逃逸功能,也与肿瘤原位微环境中的抑制性免疫细胞密切相关,如肿瘤相关巨噬细胞（Tumor Associated Macrphage, TAM）,耐受性树突状细胞（tolerogenicDC）以及调节性T细胞（Regulatory T Lymphocyte, Treg）等。在TIL细胞中,这些抑制性免疫细胞的存在,使基于T淋巴细胞的抗肿瘤细胞治疗之效果和安全性受到怀疑。特别是Treg细胞,其能对提纯培养的肿瘤杀伤性细胞产生干扰,并最终导致细胞治疗的质量的降低,这是学者们亟需破解的难题。Stat3基因是信号转导子和转录激活子家族（Signal transducers and activators of transcription family, Stat）的成员,是肿瘤发生发展的关键信号通路JAK1/Stat3的调控因子。其在免疫系统中同样发挥着举足轻重的作用,特别是对肿瘤微环境中介导免疫逃逸和免疫杀伤的平衡。与本研究密切相关的是,本研究前期发现,在卵巢癌肿瘤微环境中提取的TIL细胞含有Th17细胞。而IL-6-Star3-Th17轴能促进无菌性炎症,这种“癌性炎症”被发现与肿瘤发生过程密切相关,此类能促进肿瘤生长的Th17细胞与帮助肿瘤实现免疫逃逸的Treg细胞在肿瘤微环境中同时出现,这两者在肿瘤微环境中的相互作用值得深入探讨。Treg （?）田胞依其来源可分为自然发生Treg （natural Treg, nTreg）和诱导发生Treg （induced Treg, iTreg）细胞,那么对于Treg细胞是否还可以通过其抑制功能再进行亚型分类?肿瘤微环境中Treg细胞的亚型分类是否与其抑制功能相符?本研究在离体条件下,对Treg的细胞因子诱导分化尝试,是立足于对现有细胞治疗方法改进的探索。为探讨Stat3基因对CD4+T细胞的重要性,以及在进行针对Stat3基因的靶向治疗时,Stat3基因在肿瘤得中到抑制的同时,微环境中正常CD4+T细胞抗肿瘤功能的会否受到影响?我们建立了CD4+T细胞特异性Stat3敲除的小鼠,对其介导的抗肿瘤免疫功能进行评估。研究目的：明确Stat3基因敲除对CD4+T细胞的发育和功能的影响,特别是其激活后增殖、分化能力的变化；研究Stat3-/-CD4+T细胞在介导过继免疫治疗时能否继续发挥正常的支持作用；分析Stat3基因敲除导致CD4+T细胞无法扩增CD8+T细胞的确切机制；通过建立模式动物（?）FoxP3gfp小鼠离体Treg细胞功能分析模型,了解Treg细胞的亚型再分的可能性；应用小鼠水平的发现,在人体肿瘤疾病模型中求证Treg的幼稚型亚型确实存在并占据重要地位；试验离体细胞因子诱导Treg细胞分化能力,为未来进行过继细胞免疫治疗的改进提供新思路。研究内容：1.Stat3缺陷型CD4+T细胞介导的小鼠特异性抗黑色素瘤过继细胞治疗模型（1）CD4+T细胞敲除Stat3基因的小鼠模型建立及表型分析通过Floxp-Cre重组酶系统,我们建立了在CD4+T细胞中特异性敲除Stat3的16-21外显子（包含SH2结构域）的小鼠,从而分析Stat3蛋白功能失活对CD4+T细胞功能的影响。我们进行了PCR和Westemblot实验及ELISA测定细胞因子释放、FCM流式细胞术分析等一系列实验。结果显示,Stat3的敲除并不影响CD4+T细胞的发育成熟,但其TCR激活增殖能力受抑,且向Th17方向的分化能力完全缺失。（2）B16小鼠黑色素瘤移植瘤模型及过继免疫治疗疗效分析当我们以B16小鼠黑色素瘤接种Stat3-/-（?）鼠时,其抗肿瘤免疫显示出缺陷。进一步的过继免疫治疗模型研究显示,Stat3的敲除导致了CD4+T细胞在体内虽然能够被肿瘤细胞所激活,但其增殖减少而不能向CD8+杀伤性T细胞提供足够的支持使其扩增,最终导致过继细胞治疗的失效。（3）TCR受体下游信号通路与Stat3信号通路对凋亡的调控分析对于Stat3敲除所导致的CD4+T细胞增殖下降的原因我们进行了深入的探讨。当我们使用泛caspase抑制剂Z-VAD-fmk时,TCR激活导致的Stat3-/- CD4+ T细胞增殖受损得到了一定的恢复,故而推测此种凋亡增加的现象与TCR受体通路和Bcl-2凋亡通路都有关。进一步的WeStemblot实验和免疫共沉淀实验明确了,TCR复合物通过ZAP70激酶蛋白调节Stat3磷酸化激活,及下游Bcl-2家族的促凋亡蛋白上调、抑凋亡蛋白下调。2.乳腺癌肿瘤微环境中Treg细胞的亚型比例及功能的研究（1）模式动物FoxP3gfp小鼠的nTreg细胞亚型免疫抑制功能分析在我们使用FCM流式细胞术分析FoxP3gfp小鼠脾脏细胞来源的nTreg时,发现根据细胞表面标志分子CD62L和CD44可以将其进一步分为幼稚型和记忆型亚系。经MACS阴性分选、FACS阳性分选,证实这两种亚型细胞是独立的两群细胞,能够被高纯度的提纯分离。而Treg细胞免疫抑制能力试验显示,幼稚型Treg的抑制能力要强于记忆型。（2）FoxP3gfp小鼠的nTreg的各亚型诱导分化能力分析当我们将幼稚型和记忆型Treg细胞亚系分选后,进行离体细胞因子诱导分化,发现幼稚型细胞具有更强的分化潜能。而在我们进行三轮连续体外激活和细胞因子诱导分化时,幼稚型Treg细胞显示出更强的向Th17方向分化的能力,并且仍旧保留FoXP3基因的表达。对于Thl和Th2方向的分化,幼稚型和记忆型Treg细胞都表现出不稳定性,但是其都能够向Thl方向大量转化。（3）乳腺癌患者外周血及TIL中Treg细胞亚型分析以乳腺癌作为肿瘤疾病模型,我们使用FCM流式细胞术分析了乳腺癌患者外周血及肿瘤微环境中提取的TIL含Treg细胞的亚系比例。结果发现,不论使用CD45RA还是CD62L幼稚型细胞表面标志来区分Treg,其幼稚型亚系的比例在乳腺癌患者外周血中所占比例要高于健康人对照。在提取的TIL细胞中幼稚型Treg也占到比较大的比重。结论与创新：1。CD4+T细胞敲除Stat3基因后其在小鼠体内的发育与分布不受影响。2.Stat3基因敲除导致CD4+T细胞向Th17分化受抑,但Th1.Th2.Treg方向的分化不受影响；因而其分泌IL-17a能力下降,但其余多种细胞因子不受明显影响。3.Stat3-/- CD4+ T细胞在离体TCR受体激活时增殖受抑、凋亡增加；且此种凋亡能够被泛caspase抑制剂Z-VAD-fmk逆转。4.此种Stat3基因敲除的CD4+T细胞不能产生有效的抗肿瘤免疫；并经过继免疫治疗模型的反复验证,Stat3-/- CD4+ T细胞介导的抗肿瘤免疫能力下降与其TCR激活后凋亡而不能扩增CD8+T细胞有关。5.进一步的TCR信号通路和凋亡信号通路的分析表明,TCR受体激活通过ZAP70继续激活Stat3磷酸化,进而调控Bcl-2家族的信号传导通路受损是Stat3-/CD4+T细胞不能发挥正常抗肿瘤免疫功能的原因。6.模式动物FoxP3gfp小鼠的nTreg细胞可以通过细胞表面标志分子CD62L/CD44进一步分为幼稚型Treg（CD4+/FoXP3-GFP+/CD62L+/CD44-,naive Treg）和记忆型Treg细胞（CD4+/FoxP3-GFP+/CD62L-/cD44+, memory Treg）.7.经MACS. FACS技术分选后,可以观察到幼稚型和记忆型Treg确为两群独立的细胞,可以进行高纯度的分离。8.在体外免疫抑制功能检测实验中,幼稚型Treg显示出更强的抑制功能。9.在离体细胞因子诱导分化实验中,幼稚型Treg显示出更强的向其他T辅助细胞系转分化的能力。10.在乳腺癌患者外周血中,CD45RA+的幼稚型Treg和CD62L+的幼稚型Treg在总CD4+T细胞中的比例都有所上升。11.在乳腺癌患者肿瘤原位提取的TIL细胞中,CD45RA+的幼稚型Treg未见明显升高,但CD62L+的幼稚型Treg占据的比例大大增加。
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