野生型和突变型FGFR2IIIc胞外段的原核表达及其对肿瘤的抑制作用

论文摘要

将野生型和S252W突变型FGFR2Ⅲc胞外段基因克隆到pET3c载体,通过大肠杆菌工程菌株以包涵体形式表达重组蛋白。凝胶层析法复性,肝素亲和层析纯化后,得到纯度大于95%的目的蛋白。通过表面等离子共振,从分子水平测定复性后FGFR2Ⅲc胞外段与FGF-2的亲和力,结果表明复性及纯化后的野生型及S252W突变型FGFR2Ⅲc胞外段与FGF-2之间存在特异性结合。S252W突变型受体胞外段与FGF-2的结合力比野生型受体胞外段与FGF-2的结合力更强。通过Western blotting检测细胞膜上FGFRs磷酸化水平的变化;MTT法,流式细胞术,从细胞水平证实野生型及S252W突变型FGFR2Ⅲc胞外段对前列腺癌DU145细胞的增殖具有抑制作用,S252W突变型可溶性FGFR2Ⅲc胞外段的抑制作用更显著。通过裸鼠乳腺癌MCF-7细胞移植瘤模型,BALB/C鼠乳腺癌4T1细胞的肺转移模型,鸡胚尿囊膜模型从在体水平证明野生型及S252W突变型FGFR2Ⅲc胞外段对乳腺癌的生长,转移及血管形成有抑制作用,S252W突变型可溶性FGFR2ⅢC胞外段的抑制作用更显著。以上结果表明,FGFR2Ⅲc胞外段对肿瘤具有明显的抑制作用,可作为广泛的抗肿瘤药物开发。

论文目录

• 摘要
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• 英文缩略词
• 第一章 前言
• 1.1 成纤维细胞生长因子简介
• 1.2 成纤维细胞生长因子受体的概述
• 1.2.1 FGFRs的结构
• 1.2.2 FGF和FGFR的相互作用
• 1.2.3 FGFR2胞外段的突变
• 1.3 FGF/FGFR与肿瘤的关系
• 1.3.1 FGFs与肿瘤的关系
• 1.3.2 FGFR与肿瘤的关系
• 1.4 FGFR胞外段可成为治疗肿瘤的药物
• 1.5 FGFR2Ⅲc胞外段的设计思路
• 1.6 本研究的的目的与主要内容
• 1.6.1 研究意义
• 1.6.2 主要研究路线和内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要仪器
• 2.2 材料
• 2.2.1 细胞株及实验动物
• 2.2.2 菌株及质粒
• 2.2.3 工具酶和试剂盒
• 2.2.4 常用试剂
• 2.2.5 试剂配方
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 FGFR2内源表达及突变的检测
• 2.3.2 FGFR2Ⅲc胞外段的克隆
• 2.3.3 截短型FGFR2Ⅲc基因的表达与鉴定
• 2.3.4 菌体破碎和包涵体清洗
• 2.3.5 包涵体变性及凝胶层析复性
• 2.3.6 复性后蛋白通过结合肝素亲和层析纯化
• 2.3.7 复性后FGFR2Ⅲc胞外段的鉴定
• 2.3.8 体外实验研究FGFR2Ⅲc胞外段对前列腺癌DU145细胞的抑制作用
• 2.3.9 FGFR2Ⅲc胞外段对Balb/c（nu/nu）裸鼠人源性乳腺癌MCF-7细胞移植瘤生长的抑制作用
• 2.3.10 利用Balb/c小鼠乳腺癌细胞4T1的肺转移模型研究FGFR2Ⅲc胞外段对肿瘤转移的抑制作用
• 2.3.11 鸡胚尿囊膜血管模型研究FGFR2Ⅲc胞外段对血管形成的抑制作用
• 第三章 实验结果
• 3.1.肿瘤细胞中FGFR2内源表达及突变的检测
• 3.1.1 mRNA水平的检测
• 3.1.2 蛋白表达水平的检测
• 3.1.3 肿瘤细胞中表达的FGFR2是否突变的检测
• 3.2 FGFR2Ⅲc胞外段的制备
• 3.2.1 FGFR2Ⅲc胞外段的克隆
• 3.2.2 FGFR2Ⅲc胞外段的表达
• 3.2.3 包涵体的凝胶层析复性
• 3.2.4 复性后蛋白通过结合肝素亲和层析纯化
• 3.3 复性后FGFR2Ⅲc胞外段的鉴定
• 3.3.1 免疫印迹鉴定复性后的蛋白
• 3.3.2 串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-TOF-MS）测定复性后蛋白的分子量
• 3.3.3 等离子共振检测FGFR2Ⅲc与bFGF的结合力
• 3.3.4 MTT法检测FGFR2Ⅲc胞外段对FGF-2促NIH3T3细胞增殖活力的抑制作用
• 3.4 体外实验研究FGFR2Ⅲc胞外段对前列腺癌DU145细胞增殖的抑制作用
• 3.4.1 MTT法检测FGFR2Ⅲc胞外段对DU145细胞增殖的抑制作用
• 3.4.2 流式细胞仪检测FGFR2Ⅲc胞外段对前列腺癌DU145细胞周期的影响
• 3.4.3 Western blotting检测前列腺癌DU145细胞膜上FGFRs磷酸化水平的变化
• 3.5 在体水平研究FGFR2Ⅲc胞外段对Balb/c（nu/nu）裸鼠乳腺癌MCF-7细胞移植瘤生长的抑制作用
• 3.6 免疫组化分析CD31,CD34在裸鼠肿瘤组织石蜡切片中的表达
• 3.7 FGFR2Ⅲc胞外段对Balb/c小鼠乳腺癌4T1细胞肺转移的抑制作用
• 3.8 鸡胚尿囊膜血管模型研究FGFR2Ⅲc胞外段对血管形成的作用
• 第四章 讨论
• 4.1 检测FGFR2Ⅲc及FGFR2Ⅲb在肿瘤细胞中的表达及突变的重要性
• 4.2 包涵体的复性策略
• 4.3 复性后蛋白的鉴定
• 4.4 细胞学水平研究FGFR2Ⅲc胞外段对前列腺癌DU145细胞的抑制作用
• 4.4.1 FGFR2Ⅲc胞外段对前列腺癌DU145细胞增殖的抑制作用
• 4.4.2 FGFR2Ⅲc胞外段对前列腺癌DU145细胞膜上FGFRs磷酸化水平的抑制作用
• 4.5 在体水平研究FGFR2Ⅲc胞外段对肿瘤生长,转移及血管形成的抑制作用
• 4.5.1 FGFR2Ⅲc胞外段对血管形成的抑制作用
• 4.5.2 FGFR2Ⅲc胞外段对Balb/e（nu/nu）裸鼠乳腺癌MCF-7细胞移植瘤生长的抑制作用
• 4.5.3 FGFR2Ⅲc胞外段对Balb/c小鼠乳腺癌4T1细胞的肺转移的抑制作用
• 第五章 实验结论及展望
• 5.1 实验结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 1.野生型FGFR2Ⅲc胞外段克隆测序结果
• 2.S252W突变型FGFR2Ⅲc胞外段克隆测序结果
• 3.前列腺癌DU145细胞FGFR2Ⅲc测序结果
• 4.前列腺癌DU145细胞FGFR2Ⅲb测序结果
• 5.前列腺癌PC3细胞FGFR2Ⅲc测序结果
• 6.前列腺癌PC3细胞FGFR2Ⅲb测序结果
• 7.前列腺癌LNCaP细胞FGFR2Ⅲc测序结果
• 8.前列腺癌LNCaP细胞FGFR2Ⅲb测序结果
• 9.乳腺癌MCF-7细胞FGFR2Ⅲc测序结果
• 10.乳腺癌MCF-7细胞FGFR2Ⅲb测序结果
• 11.乳腺癌MDA-MB-231细胞FGFR2Ⅲc测序结果
• 12.乳腺癌MDA-MB-231细胞FGFR2Ⅲb测序结果
• 13.复性后的野生型-FGFR2Ⅲc胞外段的飞行时间质谱结果
• 14.复性后S252W-FGFR2Ⅲc胞外段的飞行时间质谱结果
• 致谢