β-淀粉样蛋白对海马神经元的急性损伤及其机理研究

论文摘要

β淀粉样蛋白（Aβ）在细胞外沉积形成老年斑是Alzheimer’s病（AD）的主要神经病理学特征之一。Aβ被认为在神经变性及其相关的认知和行为异常中起着关键作用。大量的证据显示Aβ纤维发挥了多种神经毒性作用,而且最近的研究显示,早期中间体状态的Aβ也可以显著地抑制突触功能。然而,Aβ损害突触和其他神经元功能的细胞机制仍不清楚。我们使用体外原代培养的海马神经元为模型,详细探讨了Aβ损伤神经元功能的早期作用机理,主要取得了如下结果:首先,不同的Aβ毒性片段对于海马神经元细胞浆中基础钙离子浓度([Ca2+]i)和网络上的同步自发钙震荡影响不同。Aβ25-35对基础[Ca2+]i几乎没有影响,却迅速抑制网络上的同步自发钙震荡。Aβ1-42对钙震荡的作用与Aβ25-35类似,但它缓慢的增加基础[Ca2+]i。然而Aβ1-40对基础[Ca2+]i和钙震荡都没有明显影响。其次,Aβ急性抑制海马神经元中线粒体的快速转运,却不引起明显的细胞死亡和显著的形态学改变。这种急性的线粒体转运抑制与线粒体膜电位的丧失以及细胞骨架的异常改变无关。Aβ也不是通过引起显著的钙信号改变来影响线粒体转运的。再次,抑制蛋白激酶A（PKA）不影响线粒体转运,而激活PKA或抑制糖原合成酶3β（GSK3β）可以减轻Aβ对线粒体转运的抑制作用,说明Aβ可能通过直接抑制GSK3β损伤线粒体转运,激活PKA可以通过调节GSK3β的活性来减轻Aβ对线粒体转运的损伤。最后,Aβ作用于海马神经元至少在6小时以后才能观察到明显的细胞死亡,说明Aβ对钙信号的影响和对线粒体转运的抑制不是由于细胞死亡导致的。而激活PKA和抑制GSK3β可以减轻Aβ诱导的神经细胞死亡,说明PKA和GSK3β在AD相关的病理过程中起着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 Alzheimer’s 病的简介
• 1.1.1 Alzheimer’s 病的流行病学和病理特征
• 1.1.2 Alzheimer’s 病的发病机理
• 1.1.3 Alzheimer’s 病的治疗
• 1.2 β 淀粉样蛋白
• 1.2.1 Aβ的生成和代谢
• 1.2.2 Aβ的毒性作用
• 1.3 神经元网络的钙震荡
• 1.3.1 同步自发钙震荡的概述
• 1.3.2 同步自发钙震荡产生的机制及内、外源性因子的调控
• 1.3.3 同步钙震荡的生理意义
• 1.3.4 AD 与钙信号
• 1.4 神经元中的物质运输
• 1.4.1 神经元中定向转运的概述
• 1.4.2 线粒体的轴突转运
• 1.4.3 轴突转运与疾病发生
• 1.4.4 AD 相关的蛋白参与轴突转运
• 1.5 本文研究的目的
• 第2章 Aβ 对海马神经元及其网络中钙信号的急性作用
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原代海马神经元培养
• 2.2.2 Aβ肽的处理
• 2.2.3 细胞免疫染色方法
• 2.2.4 钙成像的实验过程
• 2.2.5 钙震荡的定量分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 培养海马神经细胞的鉴定
• 2.3.2 海马神经元网络同步自发钙震荡的机理研究
• 25-35急性抑制海马神经元网络上的同步自发钙震荡'>2.3.3 Aβ_25-35急性抑制海马神经元网络上的同步自发钙震荡
• 25-35抑制钙震荡的时间依赖性'>2.3.4 Aβ_25-35抑制钙震荡的时间依赖性
• 25-35对胞浆中基础钙离子浓度的影响'>2.3.5 Aβ_25-35对胞浆中基础钙离子浓度的影响
• 2.3.6 其它Aβ片段对钙信号的影响
• 2.4 讨论
• 第3章 Aβ 对神经元中线粒体转运的急性抑制
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 溶液的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 原代海马神经元培养
• 3.2.2 原代小脑颗粒细胞培养
• 3.2.3 Aβ肽的处理
• 3.2.4 线粒体的成像和定量
• 3.3 结果
• 25-35对海马神经元中线粒体转运的急性抑制'>3.3.1 Aβ_25-35对海马神经元中线粒体转运的急性抑制
• 25-35抑制海马神经元中线粒体转运的时间依赖性'>3.3.2 Aβ_25-35抑制海马神经元中线粒体转运的时间依赖性
• 3.3.3 其它Aβ片段对神经元中线粒体转运的影响
• 3.4 讨论
• 第4章 Aβ 急性抑制海马神经元中线粒体转运的机理研究
• 4.1 材料和试剂
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 溶液的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 原代海马神经元和小脑颗粒细胞培养以及Aβ肽的处理
• 4.2.2 荧光免疫染色和定量分析
• 4.2.3 GFP-actin 质粒的转化与扩增
• 4.2.4 钙磷酸盐沉淀转染法
• 4.2.5 线粒体膜电位的检测
• 4.2.6 钙成像
• 4.2.7 线粒体的成像和定量
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 Aβ对微丝和微管细胞骨架的影响
• 4.3.2 Aβ对神经元线粒体膜电位的影响
• 4.3.3 Aβ对线粒体转运的抑制与钙信号的关系
• 4.3.4 PKA 和 GSK3β参与了Aβ对线粒体转运的急性作用
• 4.4 讨论
• 第5章 Aβ 对线粒体转运的抑制与其所至细胞凋亡的关系
• 5.1 材料和试剂
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 溶液的配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 原代海马神经元的培养与Aβ肽的处理
• 5.2.2 Hoechst 33342 染色观察细胞凋亡
• 5.2.3 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity 试剂盒检测细胞存活
• 5.2.4 胎盘兰排除法活体检测细胞死亡
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 Aβ长时间作用才能诱导细胞死亡
• 5.3.2 激活PKA 或抑制GSK3β对 Aβ诱导细胞死亡的保护作用
• 5.4 讨论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果