牛Akirin1基因对牛成肌细胞分化的影响研究

论文摘要

脊椎动物的肌纤维在胚胎期形成,出生后数目不再改变。出生后肌肉的生长主要依赖卫星细胞的增殖分化而导致肌纤维长度增加和周径增大即肥大,而不是依赖肌细胞数目的增多即增生。研究肌肉发生的机制对于了解胚胎发育、细胞增殖与分化具有重要意义。脊椎动物生肌过程除由经典的生肌决定因子家族（MRFs）、心肌细胞增强子2家族（MEF2s）以及肌肉生成抑制素（MSTN）调控外还依赖于其他众多调节因子。这里我们研究了转录因子akirin1基因对牛成肌细胞分化的影响,以期为产肉动物肉质和产量的提高及肌营养不良和肌肉重生的治疗等临床应用提供理论依据,并为后续的转基因牛提供理论基础。本实验应用RT-PCR的方法扩增了牛akirin1基因594bp的CDS区域,构建了akirin1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-akirin1,使用PEI转染技术使akirin1基因在牛成肌细胞中瞬时高效表达。利用Real-time PCR技术检测了akirin1转染细胞前后akirin1基因和肌肉分化标志性基因myogenin、MCK的mRNA表达水平变化,western blot技术检测了MRFs家族成员myogenin的蛋白水平在转染akirin1基因前后的变化。应用软件和在线网站对akirin1基因进行生物信息学分析,初步预测了akirin1蛋白的保守结构域和功能域,并预测了myogenin基因启动子上游的转录因子结合位点。最后还使用双荧光素酶报告基因检测系统研究了akirin1基因对myogenin基因启动子活性的影响。使用重组质粒pIRES2-EGFP-akirin1转染成肌细胞后的24h、48h、72h均能观察到绿色荧光表明akirin1基因在成肌细胞中得到表达。通过Real-time PCR检测到akirin1表达载体转染成肌细胞后的24h、48h、72h时间点akirin1基因均有高水平表达,肌肉分化相关的基因myogenin和MCK的mRNA水平也有不同程度的升高。Western blot检测到转染akirin1 24h、48h、72h后myogenin的蛋白水平均高于对照组,并且转染akirin1后myogenin的表达时间提前。双荧光素酶报告基因检测系统证明,akirin1能够通过增强myogenin启动子的活性从而促进myogenin的表达,最终促进肌肉分化。结论:akirin1的过表达能够促进肌肉分化相关基因的表达,这种对肌肉分化的促进作用机制之一是通过促进myogenin启动子活性实现的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 肌肉分化相关基因研究进展
• 1.1.1 MRFs 家族研究进展
• 1.1.2 MEF2s 与肌肉形成
• 1.1.3 MSTN 与肌肉分化
• 1.1.4 IGFs 与肌肉分化
• 1.1.5 脂肪因子与肌肉分化
• 1.2 Akirin1 基因与肌肉发生
• 1.2.1 Akirin1 的结构与定位
• 1.2.2 Akirin1 的表达
• 1.2.3 Akirin1 与细胞周期
• 1.2.4 Akirin1 与肌肉分化
• 1.2.5 Akirin1 与肌肉再生
• 1.2.6 Akirin1 与细胞迁移
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 牛Akirin1 基因CDS 区域的克隆与测序
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 真核表达载体pIRES2-EGFP-akirin1 的构建
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 成肌细胞的传代培养和转染
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.4 Real-time PCR 检测转染akirin1 后相关基因的表达变化
• 2.4.1 实验材料
• 2.4.2 实验方法
• 2.5 Western blot 检测转染akirin1 后MyoG 的表达变化
• 2.5.1 实验材料
• 2.5.2 实验方法
• 2.6 Akirin1 基因的生物信息学分析
• 2.6.1 实验材料
• 2.6.2 实验方法
• 2.7 Akirin1 基因对MyoG 启动子活性的影响研究
• 2.7.1 实验材料
• 2.7.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 荷斯坦牛akirin1 基因的扩增
• 3.2 牛akirin1 基因真核表达载体的构建与鉴定
• 3.3 成肌细胞的培养与诱导分化
• 3.4 Akirin1 表达载体瞬时转染牛成肌细胞
• 3.5 Real-time PCR 检测akirin1 以及肌肉分化相关基因的表达变化
• 3.5.1 Akirin1 mRNA 表达量检测
• 3.5.2 myogenin mRNA 表达量检测
• 3.5.3 MCK mRNA 表达量检测
• 3.6 Western blot 检测MyoG 蛋白水平的变化
• 3.7 牛Akirin1 基因的生物信息学分析
• 3.7.1 基因产物与已知蛋白质的序列比对
• 3.7.2 牛akirin1 保守结构域的预测
• 3.7.3 牛myogenin 启动子区域转录因子结合位点的分析
• 3.8 牛Akirin1 对myogenin 启动子活性的影响研究
• 4 讨论
• 4.1 转染试剂的选择
• 4.2 成肌细胞转染和诱导分化的细节
• 4.3 Akirin1 基因对成肌细胞分化的影响
• 4.4 Akirin1 基因的生物信息学分析
• 4.4.1 Akirin1 基因同源性的分析
• 4.4.2 Akirin1 保守结构域的分析
• 4.4.3 myogenin 基因启动子转录因子结合位点的分析
• 4.5 Akirin1 对myogenin 启动子活性的影响研究
• 4.6 对后续工作的展望
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 Akirin1 的测序结果
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文