论文摘要
目的:恶性肿瘤的转移和复发是导致肿瘤治疗失败的主要原因,肿瘤转移过程是一个复杂多步骤的癌细胞与宿主细胞相互作用的连续过程,包括癌细胞从原发灶脱离,侵袭周围组织,进入循环系统,逃避免疫监视,形成肿瘤血管,在远处器官形成转移灶。其中一个关键而必需的步骤是肿瘤细胞穿越基底膜,降解细胞外基质,侵袭周围组织和血管。阻断肿瘤细胞的转移和扩散是降低肿瘤死亡率和提高生存率的关键因素。但是,目前肿瘤转移的分子机制尚不清楚,缺乏有效的生物防治手段和措施,这也正是该研究领域所面临的重大研究课题。近年的研究提示,硫酸肝素糖蛋白（heparan sulfate proteoglycan,HSPG）是阻止肿瘤细胞转移和扩散屏障的重要构成成分,对其降解将破坏细胞外基质和基底膜的结构,促进肿瘤浸润和转移。乙酰肝素酶（heparanase）是一种内源性β-葡萄糖醛酸酯酶,识别HSPG的多糖侧链-硫酸肝素链（heparan sulfate, HS）的特异结构,并将其降解为10-20个糖单位大小的短糖链。在肿瘤转移的过程中,肿瘤细胞过度表达乙酰肝素酶破坏细胞外基质和基底膜,降低细胞间质屏障功能,促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁;另外,此酶还使细胞外基质中贮存的各种生物活性物质释放,诱发新生肿瘤血管形成;在人类肿瘤组织中,乙酰肝素酶的表达与肿瘤的侵袭转移程度、预后差呈显著正相关;动物实验更为其促进肿瘤转移提供了直接的证据。乙酰肝素酶是迄今发现的唯一作用于细胞外基质多聚糖成分的酶,为我们提供了一个研究开发抗肿瘤转移新药物的重要靶点,深入研究其结构、功能及其在肿瘤转移中的分子机理并在此基础上开发其抑制剂将为肿瘤转移的治疗提供新方法。目前,国外己经克隆出乙酰肝素酶的全长cDNA,并在酵母细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞中表达出此蛋白。但是,有关乙酰肝素酶作为重要的抗肿瘤转移药物的研究尚刚刚开始,对其生物学特性、表达调控机制等方面的研究报道甚少,国内此类研究更属空白。得到乙酰肝素酶的基因序列,构建、筛选有效的蛋白表达载体和宿主细胞并得到纯化蛋白和抗体以及了解此酶的表达调控影响因素等是进一步研究中国人肿瘤组织乙酰肝素酶的变化特征和规律,以及研发具有自主权的抗乙酰肝素酶药物等的重要基础和前提。本研究利用细胞培养、基因分离、克隆、表达等技术,分离乙酰肝素酶编码cDNA的全序列并在哺乳动物细胞中表达乙酰肝素酶蛋白,探讨该酶在细胞内的表达特征,加深对乙酰肝素酶生物学特性的了解,并为进一步了解乙酰肝素酶在防治肿瘤转移和扩散、判断预后等方面的生物学作用奠定了重要的基础。材料和方法:1、细胞总mRNA中乙酰肝素酶基因的分离扩增:培养HepG2细胞,待细胞生长至80%汇合时,收集细胞,提取细胞总mRNA,反转录合成cDNA;设计乙酰肝素酶基因的上下游引物序列,以cDNA为模板,扩增编码基因的全长;直接将PCR产物克隆入pGEM-T克隆载体中进行测序鉴定。2、乙酰肝素酶在哺乳动物细胞中的表达:真核表达载体的构建:运用分子克隆技术分别将乙酰肝素酶全长编码cDNA克隆入真核表达载体中,构建pcDNA3.1（+）-full HPA载体,用PCR、酶切和测序的方法鉴定序列。筛选恒定表达乙酰肝素酶的CHO-K1细胞株:将pcDNA3.1（+）-full HPA真核表达载体转染CHO-K1细胞,用G418筛选恒定表达细胞株,用PCR和Western blot检测CHO-K1细胞中基因转染和蛋白表达的情况。结果:分离扩增的酰肝素酶基因经1%琼脂糖凝胶电泳分析,大小约为1.6kb左右,与目的片段预期大小一致。其测序结果显示序列为1632bp,为人乙酰肝素酶编码cDNA全长,序列完全正确,无任何突变。构建的真核表达载体pcDNA3.1（+）-full HPA经PCR和酶切鉴定,目的片段大小与预期一致,为1.6 kb,测序结果显示目的片段克隆正确,序列无突变和移码。筛选出恒定表达完整乙酰肝素酶蛋白的CHO-K1细胞株。结论:本研究分离出人乙酰肝素酶编码cDNA全序列,使表达其蛋白成为可能,为进一步研究该酶的生物学特性及其与肿瘤转移的关系奠定了重要基础。筛选出恒定表达完整乙酰肝素酶蛋白的CHO-K1细胞株,此细胞株的建立为进一步研究此酶的功能提供了有力的工具。