肝癌血管内皮细胞不同亚型的分离培养、鉴定及比较

论文摘要

目的：肝细胞癌（hepatocellular Carcinoma, HCC） （简称肝癌）位居全球恶性肿瘤死因的第三位,而在我国的发病率居全球首位,是我国第二位肿瘤死亡原因。丰富而又扭曲的多血管是肝癌的重要特性,抗血管生成已成为治疗肝癌的主要手段之一,其主要的分子靶点是肿瘤血管内皮细胞（tumor endothelial cell, TEC）的表面受体。本研究主要通过用免疫磁珠分选技术分选、获得肝癌TEC以及对不同亚型TEC进行研究和比较,为进一步肿瘤血管生成机制和抗血管生成药物研究奠定基础。材料和方法：选用2009年10月—2011年3月从中山医院肝肿瘤外科根治性切除的患者的无菌肿瘤组织和癌周肝组织,入选标准为乙肝阳性、AFP阳性,且病理诊断为肝细胞癌,术前未接受任何抗肿瘤治疗的患者。收集10例肿瘤组织和癌周组织采用免疫磁珠分选技术从肝癌组织和癌周肝组织中获得CD105+、CD31+的TEC和肝血管内皮细胞（NEC）,并保留肿瘤组织、外周血,记录患者的临床病理特征和生存信息。获得内皮细胞后进行体外培养选取3-5代细胞进行后续实验：采用形态学观察、流式检测CD105、CD31、CD68以及α-SMA的表达、RT-PCR检测AFP的表达对阳性分选细胞进行纯度鉴定,以排除巨噬细胞,成纤维细的污染；通过乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）摄取实验、小管生成实验验证阳性分选细胞是否具有血管内皮细胞的功能；通过增殖实验检CD105+/CD31+TEC不同增殖能力以及抗血管生成药物作用下的抵抗能力的变化；测通过流式细胞仪技术检测阳性分选细胞中内皮细胞在抗血管生成药物作用前后以及不同浓度对VEGFR1、VEGFR2的表达变化。结果：形态学观察发现CD105+TEC呈细长“纤维条索状”,CD31+TEC则呈“梭形”,NEC为“铺路石样”；流式检测TEC表达CD68和α-SMA低于5%,排除巨噬细胞和成纤维细胞污染；PCR检测CD105+TEC、CD31+TEC甲胎蛋白mRNA显著低于分选后得到的肿瘤细胞中AFP的表达（P<0.05）,表明EC高度富集；内皮细胞特异性功能实验：Dil-Ac-LDL摄取实验发现95%以上阳性分选细胞（TEC和NEC）呈阳性；增殖实验检测CD105+和CD31+TEC生长48 h的吸光度值分别为0.45±0.04和0.35±0.02（P=0.023）,CD105+TEC增殖能力强于CD31+TEC;小管形成实验发现TEC在Matrigel胶中可形成毛细管网状结构,CD31+TEC强于CD105+TEC,均强于NEC；抗血管生成药物作用于CD105+TEC、CD31+TEC,低浓度时CD105+TEC比CD31+TEC有较强的耐药抵抗能力,而抗血管药物在高浓度时（＞10uM/L）, CD31+TECD对抗血管生成药物的抵抗能力要高于CD105+TEC;采用流式细胞仪技术检测不同亚型TEC和NEC（包括CD105+TEC/NEC和CD31+TEC/NEC）中VEGFR1、VEGFR2的表达情况,发现不同亚型之间的VEGFR1、VEGFR2的表达存在差异,但无统计学差异,抗血管生成药物干预后流式细胞仪检测发现NEC表面的VEGFR1、VEGFR2降低更明显,同时VEGFR1、VEGFR2在CD105+TEC中的表达减少比CD31+TEC更明显。结论：应用免疫磁珠分选技术成功分选出肝癌和癌旁组织中的血管内皮细胞,并选用CD105和CD31两种内皮细胞标记物成功分选得到CD105+TEC/NEC和CD31+TEC/NEC通过形态学以及生物学的研究比较,可以发现不同来源（肿瘤和癌旁）和不同标志物（CD105和CD31）分选的内皮细胞间存在差异,这种差异还需要进一步通过扩大样本量来证明。应用价值：不同亚型的TEC表面受体的不同,这可能是抗血管治疗作用于肝癌患者产生不同效果以及导致耐药的主要原因,同时有助于进一步为抗血管生成的分子靶向治疗寻找新的靶点和探索耐药机制。创新点：证实肝癌中存在不同亚型的TEC,并且其在生物学行为和功能上以及与抗血管生成药物相关的表面受体存在差别。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分:人肝癌血管内皮细胞的分离、培养和鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:不同亚型人肝癌血管内皮细胞的比较
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 文献综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢