牛羊白细胞介素-18基因的克隆和表达

论文题目: 牛羊白细胞介素-18基因的克隆和表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 刘文强

导师: 赵宏坤

关键词: 白细胞介素,山羊,奶牛,表达,羊痘病毒,白介素,结合蛋白,活性

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 牛羊白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)及其受体在家畜养殖业中是一种具有广阔应用前景的新型免疫佐剂和免疫治疗剂,在比较免疫学研究上也具有一定意义。根据已发表的IL-18 成熟蛋白cDNA 序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR 技术从山羊肺泡巨噬细胞和LPS/ConA 活化的脾细胞中扩增到编码山羊IL-18 成熟蛋白基因,其大小为480bp。将该基因克隆到pMD18-T 载体中,经序列测定表明山羊IL-18 与奶牛和绵羊的IL-18 基因序列高度同源,而且Caspase-1酶切位点的氨基酸序列没有发生变异,决定IL-18 活性的两个关键氨基酸位点也没有发生变异。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32a(+)质粒中。将重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中以1mol/L IPTG 诱导4h 或者更长时间进行表达。经SDS-PAGE 试验检测到了gIL-18 与pET 载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后,免疫小鼠制备多克隆血清,经Western-blotting 试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性,证实该蛋白具有诱导MDBK 细胞分泌IFN-γ的生物学活性,这为gIL-18 的实际应用奠定了基础。以β-actin 为内参照,使用半定量RT-PCR 法对来源于山羊肺脏单核巨噬细胞、外周血单核细胞(PBMC)、脾单个核细胞、肝细胞、肾单个核细胞、大脑和心肌组织的IL-18 mRNA 的表达进行了测定。结果表明:不论是否加入刺激剂,肺泡巨噬细胞都可以持续的表达IL-18 mRNA,但是被LPS 活化的PBMC 只是微弱的表达IL-18 mRNA,肝和脾细胞经LPS活化后也可以检测到IL-18 mRNA的表达,其水平明显高于PBMC,其它细胞和组织没有检测到IL-18 mRNA。这种在不同细胞中表达的差异可能反映了其产生成熟IL-18 的能力。IL-18结合蛋白(IL-18BP)具有拮抗IL-18生物学活性的作用,可视为IL-18的拮抗剂。以往的研究发现正痘病毒属的几种病毒基因组都含有编码IL-18BP的基因序列。在羊痘病毒基因组序列中也可能有编码IL-18BP的同源基因。以羊痘病毒作为模板,设计一对特异性引物,经PCR扩增了gIL-18BP基因,将该基因克隆到表达载体pET32a(+)中,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了融合表达。目的蛋白以包涵体形式存在。表达产物经过变性、复性和层析纯化后,具有体外抑制羊IL-18刺激MDBK细胞产生IFN-γ的活性。这为研究IL-18主导疾病发生机制及治疗提供了理论和实践依据。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

引言

一、白细胞介素-18 研究进展

1.1 IL-18 基因结构及其表达的调节

1.2 IL-18 的合成与表达

1.3 IL-18 的受体与信号转导

1.4 IL-18 的生物学功能

1.5 IL-18 的自然拮抗

1.6 IL-18 与机体防御

1.6.1 抗细菌感染

1.6.2 抗病毒感染

1.6.3 抗真菌性感染

1.6.4 抗原虫和寄生虫感染

1.6.5 在自动免疫和炎症疾病中的作用

1.6.6 IL-18 的抗肿瘤作用

1.7 IL-18 的检测

二、动物白细胞介素-18 研究进展

2.1 猪

2.2 马

2.3 牛

2.4 羊

2.5 犬

2.6 猫

2.7 禽

三、牛羊 IL-18 研究的意义

第一章 山羊白细胞介素-18 基因克隆及其mRNA 在体内表达情况的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 载体与受体菌

1.1.3 工具酶与主要试剂

1.1.4 主要溶液配制

1.2 方法

1.2.1 细胞

1.2.2 组织

1.2.3 IL-18 cDNA 基因的RT-PCR 扩增

1.2.4 PCR 产物的纯化和克隆

1.2.5 gIL-18 基因的序列分析

1.2.6 半定量RT-PCR 测定 IL-18mRNA 在各组织中的表达水平

2 结果

2.1 山羊IL-18 基因的 RT-PCR 扩增

2.2 gIL-18 cDNA 克隆片段的序列测定

2.3 IL-18mRNA 在各组织中的表达

3 讨论

第二章 山羊IL-18 成熟蛋白基因的原核表达

1 材料与方法

1.1 载体与受体菌

1.2 有关试剂

1.3 有关仪器

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂

1.5 免疫转印有关试剂和材料

1.6 gIL-18 成熟蛋白基因原核表达载体的构建

1.6.1 重组质粒pET-gIL-18 的构建

1.6.2 重组质粒的提取与初步筛选

1.7 pET-gIL-18 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

1.7.1 重组表达质粒重新转化受体菌

1.7.2 gIL-18 融合蛋白的诱导表达

1.7.3 SDS-PAGE 样品的制备

1.8 SDS-PAGE

1.8.1 装板

1.8.2 12%分离胶

1.8.3 5%浓缩胶

1.8.4 上样电泳

1.9 重组菌表达产物多克隆抗血清的制备

1.9.1 重组菌表达产物的回收

1.9.2 免疫小鼠

1.9.3 重组菌菌体裂解物的免疫印迹(Western-blot)分析

1.10 重组融合蛋白的变性、复性和纯化

1.11 重组蛋白的活性测定

2 结果

2.1 重组表达质粒的构建

2.2 重组蛋白的表达

2.3 融合蛋白的纯化

2.4 Western-Blotting 结果

2.5 重组蛋白的活性测定

3 讨论

第三章 来源于羊痘病毒的 IL-18 结合蛋白基因的表达和初步活性分析

1 材料与方法

1.1 病毒和鸡胚

1.2 试剂

1.3 gIL-18BP 基因的克隆和序列测定

1.3.1 引物

1.3.2 DNA 模板的提取

1.3.3 PCR

1.3.4 PCR 产物的克隆

1.4 山羊 IL-18BP 基因的原核表达

1.5 表达产物的纯化

1.6 抗山羊 IL-18 活性初步检测

2 结果

2.1 IL-18BP 基因的克隆和序列测定

2.2 重组 IL-18BP 的表达和纯化

2.3 重组蛋白抗山羊 IL-18 活性测定

3 讨论

第四章 奶牛白细胞介素-18 成熟蛋白基因的克隆和原核表达

1 材料与方法

1.1 质粒和受体菌

1.2 细胞

1.3 总 RNA 的提取

1.4 bIL-18 基因的 RT-PCR 扩增

1.5 bIl-18 基因的克隆

1.6 bIL-18 基因的原核表达

2 结果

2.1 bIL-18 基因的 RT-PCR 扩增

2.2 重组bIL-18 的表达

3 讨论

结论

创新之处

参考文献

致谢

个人简介

攻读学位期间发表的论文

发布时间: 2005-10-11

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