手性芳香胺类化合物的微生物酶法拆分研究

论文摘要

手性芳香胺类化合物是重要的药物中间体,同时也用作手性助剂和手性拆分剂。本论文尝试从土壤中筛选出可用于制备手性芳香胺的微生物,希望获得高立体选择性的菌株,分别采用酰胺化反应和水解反应进行手性芳香胺的制备,以此验证微生物法制备手性芳香胺的可行性。酰胺化法：利用含油脂的平板从土壤中筛选出了一株产脂肪酶细菌,初始酶活力为172U/L。经初步鉴定,确定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）暂命名为Bacillus licheniformis strain J03。对其进行产酶条件的优化,主要考察了碳源、氮源、诱导剂对J03菌株产酶的影响,确定较适的培养基配方为蔗糖1.2%,酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%,三油酸甘油酯0.4%,K2HPO40.2%, NaCl0.5%, MgSO4·7H2O0.05%, pH7.0,培养温度30℃,转速200rpm。在该条件下产酶活力最高达到579U/L,比初始酶活提高了237%。将菌种J03冻干制备得到静息细胞,对其拆分1-苯乙胺的工艺进行研究。在反应溶剂甲基叔丁基醚中,1-苯乙胺浓度为0.5%,酰化剂甲氧基乙酸甲酯浓度为0.3%,添加静息细胞0.02g/mL,反应温度30℃,转速200rpm,转化24h,底物的转化率为36.6%,底物对映体过量值为33.5%。水解法：通过响应面法对实验室保藏菌株Aspergillus niger M041的产酶条件进一步优化,获得最适培养基配方及产酶条件为葡萄糖1.8%,蛋白胨1.79%,K2HP040.2%,MgS040.1%,NaCl0.5%, Al3+1.51mmol/L,初始pH值自然。经优化后发酵酶活力从32.4U/g上升到48.9U/g,提高了50.9%。研究M041对2-氯-N-（1-（4-氯苯基）乙基）乙酰胺的选择性水解反应,拆分工艺为：反应介质为含水量为3%的甲基叔丁基醚,静息细胞添加量0.02g/mL,底物浓度为0.2%,反应在35℃,转速为200rpm下,转化时间为24h。在此条件下,获得底物转化率为41.3%,底物对映体过量值为36.4%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 手性芳香胺类化合物拆分的研究进展
• 1.1.1 手性芳香胺化合物的研究概述
• 1.1.2 手性芳香胺类化合物的拆分方法
• 1.1.2.1 诱导结晶拆分法
• 1.1.2.2 化学拆分法
• 1.1.2.3 不对称合成法
• 1.1.2.4 生物法
• 1.2 脂肪酶在手性芳香胺类化合物合成中的应用
• 1.2.1 不同来源的脂肪酶
• 1.2.2 反应体系
• 1.2.3 其他催化方法
• 1.3 酰胺酶在手性芳香胺制备中的应用
• 1.3.1 酰胺水解酶
• 1.3.2 青霉素酰化酶
• 1.4 本课题的研究内容和意义
• 1.4.1 本课题的研究背景及选题意义
• 1.4.2 本课题的主要研究内容
• 第二章 产立体选择性脂肪酶菌株的筛选及初步鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 实验菌株
• 2.2.1.2 培养基成分
• 2.2.1.3 主要原料与试剂
• 2.2.1.4 主要溶液
• 2.2.1.5 主要实验仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1菌株旳蹄选方法
• 2.2.2.2 1-苯乙胺的检测方法气相色谱检测法
• 2.2.2.3 数据处理方法
• 2.2.2.4 脂肪酶活力测定
• 2.2.2.5 菌种的初步鉴定
• 2.2.2.6 酶反应最适pH值和最适温度的确定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 产脂肪酶菌种的平板初蹄
• 2.3.2 1-苯乙胺的标准曲线的建立
• 2.3.3 产立体选择性脂肪酶菌株的筛选结果
• 2.3.4 菌种的初步鉴定
• 2.3.4.1 形态观察
• 2.3.4.2 生理生化特征测定
• 2.3.5 酶最适pH值和最适温度的确定
• 2.3.5.1 酶反应最适pH值测定
• 2.3.5.2 酶反应最适温度测定
• 2.4 小结
• 第三章 菌株J03产脂肪酶条件优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 实验菌种
• 3.2.1.2 培养基成分
• 3.2.1.3 主要试剂
• 3.2.1.4 主要实验仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 发酵产酶实验
• 3.2.2.2 生物量的测定方法
• 3.2.2.3 脂肪酶活力测定
• 3.2.2.4 培养基组分优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基组分优化
• 3.3.1.1 碳源
• 3.3.1.2 氮源
• 3.3.1.3 诱导剂
• 3.3.2 发酵产酶时间曲线
• 3.4 本章小结
• 第四章 静息细胞拆分外消旋的1-苯基乙胺
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 实验菌株
• 4.2.1.2 培养基成分
• 4.2.1.3 主要原料与试剂
• 4.2.1.4 主要实验仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 JO3静息细胞的制备
• 4.2.2.2 静息细胞催化拆分1-苯乙胺外消旋体的基本工艺
• 4.2.2.3 数据处理方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 不同有机溶剂对催化反应的影响
• 4.3.2 酰化剂对酶催化的影响
• 4.3.3 底物浓度对酶催化反应的影响
• 4.3.4 底物与酰化剂的比例对酶催化的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 酰胺酶产生菌的筛选及利用响应面法优化其产酶条件
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.1.1 实验菌株
• 5.2.1.2 培养基成分
• 5.2.1.3 主要试剂
• 5.2.1.4 主要实验仪器
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 底物2-氯-N-（1-（4-氯苯基）乙基）乙酰胺的制备
• 5.2.2.2 菌种的蹄选
• 5.2.2.3 底物2-氯-N-（1-（4-氯苯基）乙基）乙醜胺和产物4-氣苯乙胺的HPLC法分析
• 5.2.2.4 数据处理
• 5.2.2.5 酶活的测定方法
• 5.2.2.6 Plackett-Burman实验
• 5.2.2.7 响应面实验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 底物2-氯-N-（1-（4-氯苯基）乙基）乙酰胺标准曲线的建立
• 5.3.2 产物4-对氯苯乙胺标准曲线的建立
• 5.3.3 产立体选择性酰胺酶菌株的筛选结果
• 5.3.4 响应面法优化产酶条件
• 5.3.4.1 PI acket-Burman实验
• 5.3.4.2 响应面实验
• 5.4 小结
• 第六章 黑曲霉M041水解2-氯-N-（1-（4-氯苯基）乙基）乙酰胺制备4-氯苯乙胺工艺的研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.1.1 实验菌株
• 6.2.1.2 培养基成分
• 6.2.1.3 主要试剂
• 6.2.1.4 主要实验仪器
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.2.1 静息细胞制备
• 6.2.2.2 转化反应
• 6.2.2.3 数据处理
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 反应介质的确定
• 6.3.2 有机试剂的影响
• 6.3.3 底物浓度的影响
• 6.3.4 体系水含量的影响
• 6.4 本章小结
• 第七章 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文