小麦白粉病小种特异抗性新基因Pm-M53的遗传分析

论文题目: 小麦白粉病小种特异抗性新基因Pm-M53的遗传分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 李韬

导师: 顾铭洪,辛志勇

关键词: 六倍体合成小麦,粗山羊草,白粉病抗性基因,抗谱分析,遗传模式,遗传作图,染色体定位

文献来源: 扬州大学

发表年度: 2005

论文摘要: 由小麦专化型白粉菌（Blumeria graminis DC f.sp.tritici）引起的小麦白粉病几乎在所有小麦生产区都有发生，已成为影响小麦生产的主要病害之一。培育抗病品种是防治其流行最有效、最安全的方法，而有利抗性基因资源的挖掘和高效利用则是培育抗病品种的前提，开展遗传分析可为目标基因的高效利用和后续的克隆及其抗病机制研究奠定基础。M53（YAV2/TEZ//Aegilops squarrosa249）是硬粒小麦（Triticum durum，2n=4x=28，AABB）与粗山羊草（Aegilops tauschii，2n=2x=14，DD）的双二倍体人工合成种，其对北京地区白粉菌主流小种15号和扬州地区主流小种表现免疫。本研究通过抗谱分析研究了抗性基因的来源、遗传模式以及与已命名白粉病抗性基因在抗谱上的差异；利用AFLP和SSR标记以及非整倍体分析对目的基因进行了染色体定位和遗传作图；利用抗病基因具有保守功能域的特点，采用同源克隆的方法从M53基因组DNA中分离了抗病基因类似片段（RGA），结果如下：对抗病亲本M53和感病亲本宛7107的正反交F1以及F2和F3分离群体进行了白粉菌接种，结果表明，F1正反交均表现为抗病，说明抗性受显性核基因控制，而F2单株则表现出抗感分离，x2测验表明，抗感分离比例符合3∶1，达显著水平，说明抗性受显性单基因控制。F3代植株的接种鉴定证实了F2代表型鉴定结果的可靠性。为了追踪抗性基因的来源，我们对M53及其双亲Triticum durum（YAV2／TEZ）和Ae.squarrosa249分别在苗期和成株期进行接种鉴定，结果表明，YAV2／TEZ在两个时期均表现高感，而M53和Ae.squarrosa249则全生育期表现免疫，说明抗性基因来自Ae.squarrosa249，即来自粗山羊草，该基因暂命名为Pm-M53。截至目前，已定名的白粉病抗性基因中，总共有3个位于D组染色体上，分别为Pm2，Pm19和Pm24，对其载体品种Ulka／8*Cc、XX186和赤鸭草进行了白粉菌15号生理小种接种鉴定，结果表明，Pm-M53在全生育期表现抗病，Pm19和Pm24则在全生育期表现感病；Pm2在苗期表现抗病，而在成株期表现感病，另外14个白粉菌生理小种在苗期接种也显示Pm-M53在抗谱上不同于Pm2、Pm19和Pm24，对其中5个小种表现感病，说明Pm-M53是小种特异性（race-specific）抗病基因，可能是一个新的白粉病抗性基因。分子标记技术已成为培育抗病品种、基因定位、遗传作图及图位克隆基因的主要手段和技术之一，目前已被广泛的应用于白粉病的研究。本研究结合AFLP、SSR和BSA技术，对来自杂交组合M53／宛7107的F2作图群体进行了分析，在256对AFLP引物中，所有引物对在亲本M53和宛7107间都能扩增出30个以上位点，每对引物能够检测到1～11个多态性位点，在抗感池间筛选到多态性片段16个，其中Apm109和Apm161两个片段在抗亲和抗池中能够稳定重现，而在感亲和感池中无此带，用JoinMapV3.0和Kosambi公式对F2作图群体的分析结果表明，这两个片段与目的基因紧密连锁，且位于目的基因的两侧，遗传距离分别为1.0和3.0 cM。标记Apm109在F3的抗病单株中也能够稳定重现。从70个位于D组染色体的SSR标记中，在亲本及抗感池间筛选到重现性好的多态性标记标记5个，分别为Xwmc289，Xgwm583，Xgwm292，Xgwm191和Xwmc161，除Xgwm191位于5DS上外，其余4个标记均位于5DL上。对上述多态性SSR标记在群体中的分布进行了分析，结果表明，在LOD阈值为3.0时，位于5DL上的3个SSR标记Xwmc289、Xgwm583和Xgwm292与目的基因连锁，遗传距离分别为20.0、33.0和24.0 cM，并且分布于目的基因的两侧，初步说明目的基因位于5DL上。其中标记Xwmc289在M53和宛7107各存在两个共迁移片段，这两个共迁移片段在序列上存在很大差异，但均具有1个CT重复域和1个GA重复域，在M53中共迁移的两个目的片段的大小为159bp，在宛7107中对应的两个共迁移片段的大小为161bp，相对应的等位位点之间均有3个碱基的差异，一个为C／G碱基替换，另一个为GA重复域缺失。利用JoinMap V3.0对两个AFLP标记Apm109和Apm161，以及3个SSR标记Xwmc289、Xgwm583和Xgwm292联合进行了遗传作图，结果表明这些标记分布在目的基因Pm-M53的双侧，SSR标记Xgwm583和Xwmc289以及AFLP标记Apm161分布在一侧，Xgwm292和AFLP Apm109分布在目的基因的另一侧。从着丝粒近端（proximal）到远端（distal）的排列次序依次为Xgwm583、Xwmc289、Apm161、Pm-M53、Apm109、Xgwm292。其中3个SSR标记在染色体上的排列顺序与已经建立的小麦整合图谱是一致的，但标记之间的距离存在一定差异。由于两个AFLP标记Apm109和Apm161距离目的基因较近且位于目的基因的双侧，而3个位于5DL上的SSR标记又覆盖目标基因双侧的两个AFLP标记区，进一步说明目的基因Pm-M53位于5DL上，这点也通过距离目的基因最近的AFLP标记Apm109在两个中国春缺-四体材料（CSN5BT5D、CSN5DT5B）及两个双端体材料（CSDT5DS、CSDT5DL）中的扩增情况进行了证实，标记Apm109在CSN5BT5D和CSDT5DL上有目的特异带，而在CSN5DT5B和CSDT5DS上无此条带。在植物-病原菌相互作用中，不论何种植物类型还是与其作用的何种病原菌，植物抗病基因在结构上具有高度的保守性，因此根据R基因保守区设计特异或兼并引物、用PCR的方法从基因组DNA或诱导表达的转录本cDNA中寻找和克隆抗病基因是常用的方法。本研究根据GenBank中粗山羊草的部分抗病序列以及已克隆的大、小麦抗白粉病基因的核苷酸和氨基酸序列设计了非兼并和兼并引物，在M53和宛7107以及F2单株组成的抗感池基因组DNA中进行了扩增，平均每对引物能够扩增出8个以上的位点。非兼并引物对RGAP-2和RGAP-6分别能够扩增出一条和两条多态性条带，即抗亲M53和抗池中有带，而在感亲和感池中无带，而所有兼并引物对在6％聚丙烯酰胺变性胶上均未扩增出肉眼可辨的多态性条带。我们对RGAP-2和RGAP-6产生的多态性片段分别进行了回收、克隆和测序，RGAP-2多态性片段大小331bp，而RGAP-6多态性片段之一的大小为259bp。对RGAP-2（331bp）和RGAP-6（259bp）的核苷酸序列在NCBI（http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/）中进行相似性搜索（BLASTN）时发现，与RGAP-2和RGAP-6目的片段相似性最高的几个序列均来自粗山羊草，且都与抗病有关，具有明显的LZ-NBS-LRR或NBS-LRR抗病结构保守域。利用DNAStar软件的EditSeq模块对RGAP-6和RGAP-2多态性片段进行了核苷酸到氨基酸的序列翻译，RGAP-6（259bp）多态性片段无法翻译成氨基酸，而RGAP-2（331bp）能够翻译成氨基酸，推测RGAP-6（259bp）可能是内含子或者调控序列的一部分，而RGAP-2很可能是表达序列（外显子）的一部分。利用NCBI中的BLASTX对RGAP-2翻译的氨基酸序列进行同源搜索时发现，所有命中的序列均与抗病有关，且与来自粗山羊草的LZ-NBS-LRR型抗病蛋白序列同源性最高。在与RGAP-2同源性较高氨基酸序列的比较中发现，RGAP-2目的片段及其同源序列在I（V／L）IDD（K／I）WDK、N（N／E）CGSR（I／V）I（T／A）TTRI、PLS、KIL、KCGGVPLAII等序列上高度保守，与已知R基因NB功能域的kinase2、kinase3a和GLPLAII 3个结构域具有一定的相似性。在NCBI中利用rpsblast进行功能域搜索时发现RGAP-2目的片段含有保守域NB-ARC，与来自拟兰芥的R基因RPS-2、RPM1、RPP8和RPP13，番茄的R基因Prf，12C-1和12C-2，亚麻的R基因L6，以及与人和果蝇程序性死亡相关蛋白具有较高同源性，这些结果表明RGAP-2和RGAP-6两个感兴趣片段极可能来自粗山羊草，而RGAP-2很可能与粗山羊草的抗病性有关，但较低的相似性得分与较高的E值暗示这两个序列不同于任何已知的粗山羊草序列。此外，本文还就目的基因Pm-M53与已定名白粉病抗性基因的关系、白粉病的表型鉴定、Pm-M53遗传图谱与已构建遗传图谱的差异、位点特异性标记的转化，以及克隆的RGA片段与禾本科中已克隆R基因的关系、与植物中已克隆的白粉病抗性基因的关系、与小麦和大麦中白粉菌诱导抗性相关基因或候选基因的关系进行了讨论。对麦类白粉菌的生物学特性、白粉病抗性基因的发现及其相关分子标记的开发、白粉病抗性基因的遗传特点和抗白粉病分子育种策略、植物抗病机制及抗病基因的克隆、植物抗病性构筑策略以及AFLP标记技术的原理、发展、完善、优缺点及应用等方面进行了文献综述。

论文目录:

符号说明

论文设计和立题依据

中文摘要

英文摘要

上篇:文献综述

第一章 小麦白粉病及其研究进展

1 小麦白粉病的发生和危害

2 白粉病病原菌

2.1 学名

2.2 病害症状

2.3 病原菌形态

2.4 生物学特性

2.5 病菌的越夏和越冬

2.6 病菌的侵染过程

2.7 病菌的发病条件

2.8 寄主专化性

3 白粉病抗性测定

3.1 白粉病的接种物

3.2 抗性测定

3.2.1 大田测定

3.2.2 苗期接种测定

3.3 致病力的分化

4 小麦白粉病抗性遗传

4.1 质量抗性

4.2 数量抗性

5 抗白粉病基因相关的分子标记

6 抗白粉病基因的克隆

7 小麦白粉病的防治

7.1 栽培防治

7.2 药剂防治

7.3 培育抗病品种

8 抗白粉病育种

8.1 抗源的搜集和筛选

8.2 抗源的创新

8.3 抗源的评价和利用

8.4 抗白粉病分子育种策略

参考文献

第二章 植物抗病机制

1 植物抗病机制

2 植物抗性基因

3 植物抗病基因克隆的方法

3.1 转座子标签法

3.2 图位克隆法

3.3 基于同源序列的候选基因法

4 植物抗病育种策略

参考文献

第三章 AFLP标记技术的发展和完善

1 基本原理

2 基本操作流程

3 AFLP操作流程的变革及其优缺点

3.1 酶切和连接

3.2 扩增

3.3 跑胶

3.4 扩增产物的检测

4 AFLP衍生的几种技术

4.1 SADF-AFLP 单限制性酶切选择性扩增多态性技术体系

4.2 SD-AFLP 二次消化AFLP

4.3 TE-AFLP 三限制性酶切AFLP

4.4 Substracted AFLP 差减AFLP

4.5 Microsatellite-AFLP

5 相对低通量和信息不完全AFLP技术向高通量,信息完全技术的转化

5.1 由同位素标记、生物素标记技术、银染技术向荧光标记技术的转化

5.2 AFLP指纹图谱库的建立、相关数据包的开发和自动化

5.3 AFLP显性标记向共显性标记的转化

5.4 AFLP标记向位点特异性标记或等位基因特异性标记的转化

6 AFLP技术的优越性和局限性

6.1 优越性

6.2 局限性

6.3 两歧性

7 AFLP技术在植物遗传育种中的应用

7.1 遗传多样性研究

7.2 快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记以及用于基因的精细作图和图位克隆

7.3 从AFLP片段中富集SSR

7.4 群体和保守遗传学研究

7.5 种属特异性鉴定

7.6 基因定位

7.7 分类和进化研究

7.8 正向和反向QTL作图

7.9 构建遗传连锁图谱

7.10 利用基因组文库(BAC和YAC)构建物理图谱

7.11 AFLP辅助的轮回选择育种

7.12 研究杂种优势

7.13 甲基化研究

7.14 SNP研究

7.15 转座子和T-DNA研究

7.16 研究基因表达与调控

8 AFLP实验可能遇到的问题、原因及对策

参考文献

下篇:研究报告

第一章 抗白粉病新基因的抗谱分析

引言

1 材料与方法

1.1 植物材料和病原菌

1.2 方法

1.2.1 白粉病接种

1.2.2 抗感反应型鉴定

2 结果与分析

2.1 F_1、F_2植株白粉病抗性表型鉴定

2.2 F_2衍生的F_3家系白粉病抗性表型验证

2.3 Pm-M53,Pm2,Pm19和Pm24抗谱分析

3 讨论

参考文献

第二章 Pm-M53的遗传作图和染色体定位

引言

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取与纯化

1.2.2 抗感池的建立

1.2.3 AFLP标记分析

1.2.3.1 基因组DNA的消化和接头连接

1.2.3.2 PCR扩增

1.2.3.3 选扩产物的检测

1.2.4 SSR标记分析

1.2.5 遗传作图

1.2.6 染色体定位

1.2.7 感兴趣片段的回收、克隆和测序

1.2.8 PCR扩增和验证

2 结果与分析

2.1 AFLP标记分析

2.1.1 AFLP标记在亲本间和抗感池间的多态性

2.1.2 AFLP标记在F_2分离群体中的表现

2.1.3 AFLP标记在F_3群体中的重现性

2.2 SSR标记分析

2.2.1 SSR标记在亲本间和抗感池间的多态性

2.2.2 SSR标记在F_2群体中的分离

2.2.3 SSR标记Xwmc289目的扩增带的共迁移现象

2.3 目标基因区的遗传作图

2.4 目标基因染色体定位

2.5 SCAR标记的转化

2.5.1 二次序列胶结果及菌落PCR

2.5.2 测序结果

2.5.3 特异引物扩增

3 讨论

参考文献

第三章 抗病同源片段(RGA)的分离及其分析

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 引物设计

1.2.2 PCR扩增

1.2.3 序列胶检测

1.2.4 多态性片段的回收、克隆和测序

1.2.5 序列相似性分析

1.2.6 功能域预测

2 结果与分析

2.1 非兼并引物在抗感池及亲本间的多态性

2.2 兼并引物在抗感池及亲本间的多态性

2.3 多态性片段的回收、克隆和序列

2.4 多态性片段核苷酸序列在GenBank中的相似性搜索

2.5 RGAP-2翻译的蛋白序列

2.6 RGAP-2氨基酸序列相似性搜索

3 讨论

参考文献

全文结论

后续工作打算及总体工作设想

1 下一步工作打算

2 本项研究总体工作设想

读博期间发表及即将发表的文章

致谢

发布时间: 2007-11-21

参考文献

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