农杆菌介导的瑞氏木霉转化及绿色荧光蛋白的表达研究

论文摘要

瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是一种腐生性丝状真菌,具有良好的合成和分泌蛋白的能力,可以用于纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶等多种酶类的生产,具有重要的经济价值。同时,瑞氏木霉作为低等真核生物具有结构简单、生长迅速、操作简便的优点,也是研究真菌遗传、代谢作用的重要生物材料。目前,瑞氏木霉全基因组测序工作已经完成,促进了瑞氏木霉功能基因组学的发展。建立根癌农杆菌介导的瑞氏木霉转化系统,在基因组范围内进行T-DNA随机插入突变,建立瑞氏木霉的突变体库,利用正、反向遗传学方法对不同表型突变体进行基因水平的研究,获得与突变性状相关的基因。控制重要性状基因功能的阐明有助于深入了解瑞氏木霉特有的生命现象,对瑞氏木霉分子生物学研究和指导菌株遗传改造具有重要作用。绿色荧光蛋白作为一种新型的标记基因,被广泛用做原核细胞和真核细胞的报告基因。在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿色荧光,具有稳定、灵敏度高且无需底物或辅助因子参与等优点。自绿色荧光蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中成功表达后,绿色荧光蛋白及其他荧光蛋白已得到广泛的应用,包括对多种真菌的研究,以绿色荧光蛋白作为分子标记有利于对瑞氏木霉基因表达和蛋白定位等诸多方面的研究。本文成功建立了农杆菌介导的瑞氏木霉T-DNA转化系统,利用农杆菌AGL1介导转化瑞氏木霉QM9414,得到一批瑞氏木霉T-DNA插入突变株。将来自于质粒pAN7-1的潮霉素B磷酸转移酶基因（hph）表达盒插入到Ti质粒pBI121中,构建了双元载体pBI-hph。将该双元载体导入农杆菌AGL1后,与瑞氏木霉孢子或原生质体共培养,在含潮霉素平板上得到抗性转化子。通过PCR和斑点杂交分子验证,表明T-DNA上的hph基因已插入到瑞氏木霉转化子染色体中。利用TAIL-PCR方法,从转化子中成功克隆到T-DNA插入位点侧翼序列,序列测序结果证明T-DNA随机插入到瑞氏木霉染色体中。目前已经筛选得到经过分子验证的突变株200余株,证明农杆菌介导的转化技术是一种有效的随机插入突变方法,对于瑞氏木霉功能基因组学研究具有重要意义。为实现绿色荧光蛋白在瑞氏木霉中的表达,本文将pIG1783质粒中的绿色荧光蛋白基因（egfp）表达盒片段与含乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因（pyrG）的质粒pAB4-1共转化瑞氏木霉尿嘧啶营养缺陷型突变株M23,经PCR验证筛选得到2株转化子。RT-PCR和SDS-PAGE分析结果表明egfp基因在这2株瑞氏木霉转化子中都能成功转录和翻译。荧光观察结果显示在瑞氏木霉菌丝和孢子中都可以观察到强烈的绿色荧光。在进行农杆菌介导的瑞氏木霉转化实验时,为克服以潮霉素作为筛选标记存在的筛选背景高,筛选效率低等问题,以Ti质粒pCMBIA0390为骨架构建了携带乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶（pyrG）单选择标记基因的双元载体pCMBIA-P,以及egfg和pyrG双选择标记基因的双元载体pCMBIA-OEP,以便比较不同载体在转化中的应用效果。将双元载体pCMBIA-P导入农杆菌EHA105后,在乙酰丁香酮诱导下,含双元载体pCMBIA-P的农杆菌与T.reesei M23共培养,初步筛选得到20余株转化子。PCR验证结果表明pyrG基因已经插入到转化子染色体中。含双元载体pCMBIA-OEP的农杆菌与T.reesei M23共培养后筛选得到了12株目的转化子。对转化子菌丝进行的荧光检测,可以观察到绿色荧光,证明AMT转化成功,T-DNA确实插入到T.reesei染色体上且egfp基因成功表达,对转化子性质的进一步分析正在进行中。本文建立了农杆菌介导的瑞氏木霉T-DNA转化和插入突变系统,实现了绿色荧光蛋白在瑞氏木霉中的成功表达。目前正在探索建立高效、快捷、高通量的转化子筛选技术,以尽可能多地获得瑞氏木霉AMT插入突变株,建立瑞氏木霉T-DNA标签突变体库,并对突变体进行进一步的分子鉴定和遗传分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 丝状真菌转化系统
• 1.1.1 丝状真菌转化方法
• 1.1.2 丝状真菌遗传转化系统的选择标记
• 1.1.3 丝状真菌转化载体
• 1.2 农杆菌介导的丝状真菌转化研究进展
• 1.2.1 农杆菌介导转化（AMT）技术概述
• 1.2.2 农杆菌的Ti质粒
• 1.2.3 Ti质粒的转化机理
• 1.2.4 T-DNA插入位点的分离及应用
• 1.2.5 T-DNA整合到真菌基因组的特点
• 1.2.6 农杆菌介导转化技术应用于真菌功能基因组学的优点
• 1.3 绿色荧光蛋白及其应用
• 1.3.1 绿色荧光蛋白结构及其性质
• 1.3.2 绿色荧光蛋白的发光机制
• 1.3.3 绿色荧光蛋白作为遗传标志和报告基因的特点
• 1.3.4 绿色荧光蛋白在真菌分子生物学研究中的应用
• 1.4 本文主要研究内容
• 第二章 农杆菌介导的瑞氏木霉转化及插入突变分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基和培养条件
• 2.1.3 菌种保藏技术
• 2.1.4 主要分子实验试剂
• 2.1.5 重组DNA技术
• 2.1.6 引物设计及PCR扩增条件
• 2.1.7 pBI-hph载体的构建
• 2.1.8 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.1.9 瑞氏木霉原生质体的制备
• 2.1.10 农杆菌介导转化丝状真菌瑞氏木霉
• 2.1.11 瑞氏木霉染色体提取
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 pBI-hph载体的构建结果
• 2.2.2 双元载体pBI-hph转化农杆菌AGL1
• 2.2.3 农杆菌介导瑞氏木霉转化
• 2.2.4 瑞氏木霉AMT转化子的PCR及杂交验证
• 2.2.5 T-DNA插入位点侧翼序列的TAIL-PCR克隆
• 2.2.6 插入位点的序列特征分析
• 2.3 小结
• 第三章 绿色荧光蛋白基因表达盒的瑞氏木霉转化及其表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 主要试剂及培养基
• 3.1.3 重组DNA技术
• 3.1.4 引物设计及PCR扩增条件
• 3.1.5 绿色荧光蛋白表达盒片段的获取
• 3.1.6 瑞氏木霉染色体提取
• 3.1.7 T.reesei的转化及筛选
• 3.1.8 转化子的RT-PCR验证
• 3.1.9 转化子蛋白的SDS-PAGE检测
• 3.1.10 绿色荧光的观察
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 绿色荧光蛋白表达盒的制备
• 3.2.2 T.reesei的转化及筛选
• 3.2.3 转化子的分子验证
• 3.2.4 转化子胞内蛋白的检测
• 3.2.5 转化子的荧光检测
• 3.3 小结
• 第四章 绿色荧光蛋白和尿嘧啶缺陷型双标记的农杆菌介导瑞氏木霉转化研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株及质粒
• 4.1.2 主要试剂及培养基
• 4.1.3 重组DNA技术
• 4.1.4 引物设计PCR扩增条件
• 4.1.5 双元载体的构建
• 4.1.6 农杆菌感受态的制备与转化
• 4.1.7 农杆菌介导转化丝状真菌瑞氏木霉
• 4.1.8 瑞氏木霉染色体提取
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 pCMBIA-P载体的构建结果
• 4.2.2 双元载体pCMBIA-P转化农杆菌EHA105
• 4.2.3 含pCMBIA-P双元载体的农杆菌EHA105介导的瑞氏木霉转化
• 4.2.4 pCMBIA-OEP载体的构建结果
• 4.2.5 双元载体pCMBIAOEP转化农杆菌EHA105
• 4.2.6 含pCMBIA-OEP双元载体的农杆菌EHA105介导瑞氏木霉转化
• 4.2.7 瑞氏木霉AMT转化子的验证
• 4.3 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发（待）表的学术论文目录