miRNA-21调控多发性骨髓瘤细胞生长与耐药机制研究

论文摘要

多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓聚集大量恶性浆细胞并且患者血液或尿液中出现单克隆蛋白（M蛋白）为特征的恶性疾病。目前认为MM发生是一个逐步进展的过程:患者在早期发生意义不明的单克隆球蛋白症（MGUS）,然后进展为MM,部分患者最终发展为髓外骨髓瘤（浆细胞白血病）,整个过程中骨髓恶性浆细胞（骨髓瘤细胞）伴有多种基因的突变。骨髓瘤细胞的生长及耐药与骨髓微环境密切相关。骨髓微环境内骨髓基质细胞（BMSCs）受骨髓瘤细胞刺激后,释放IL-6,IGF-1及BAFF等细胞因子或生长因子,激活骨髓瘤细胞内Jak/STAT3、PI3K/Akt、MAPK/ERK及NF-κB等生存信号,由此促进骨髓瘤细胞生长并导致耐药。研究表明MAPK/ERK信号通路是调节骨髓瘤细胞生存的重要信号,其表现为:一方面,骨髓瘤细胞与BMSCs粘附可诱导骨髓瘤细胞ERK活化,抑制ERK活化可抑制骨髓瘤细胞生长。另一方面,IL-6和IGF-1等细胞因子可激活MAPK/ERK通路,刺激细胞增殖、阻止凋亡。此外,骨髓瘤细胞与BMSCs等骨髓微环境细胞还可通过自分泌或旁分泌其它一些生长因子如VEGF和BAFF激活MAPK/ERK信号通路,从而介导骨髓瘤细胞的生长和耐药。细胞内MAPK/ERK信号通路受多种因素严密调控,受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路的负调控因子Sprouty2（SPRY2）是Sprouty蛋白家族成员之一,它通过抑制MAPK/ERK信号而遏制生长因子介导的细胞增殖、迁移及分化。研究显示SPRY2基因在前列腺癌、乳癌和恶性胶质瘤等肿瘤中表达下调或抑制,使肿瘤细胞MAPK/ERK信号失去约束过度活化,因此SPRY2被视为遏制MAPK/ERK信号的抑癌基因。MicroRNAs（miRNA）是一类长度为22nt左右的非编码小RNA,它通过抑制特定靶基因的mRNA在转录后水平调控基因的表达。miRNA-21（miR-21）是一种与肿瘤密切相关的miRNA分子,它可调节SPRY2表达。有研究表明,miR-21在骨髓瘤细胞中高表达,而且过表达miR-21可使骨髓瘤细胞抵抗IL-6缺乏引起的凋亡。那骨髓瘤细胞中是否存在miR-21抑制SPRY2的现象,从而使MAPK/ERK信号负调控机制失调而过度活化?目前尚不清楚。基于这些背景和问题,我们研究miR-21和SPRY2在MM中的表达,miR-21是否通过SPRY2调控MAPK/ERK信号,进而促进骨髓瘤细胞生存与耐药。此外,我们还初步探讨一下骨髓瘤细胞中NF-κB对miR-21基因转录的影响,从而为MM的治疗提供新的策略和靶点。第一部分循环miR-21在MM中的表达与意义近年来,研究表明血清/血浆中循环miRNA可作为一种新型的生物标志物。miR-21在多种肿瘤细胞中高表达,与肿瘤发生、侵袭及转移、耐药等行为密切相关。有研究表明miR-21在MM骨髓浆细胞表达比正常浆细胞显著升高,但MM患者外周血miR-21表达情况尚不清楚。因而,本部分我们研究MM患者循环miR-21的表达情况,并与有关临床参数进行相关性分析,以评估miR-21在MM中的意义。本部分探讨循环miR-21在MM患者血清的表达及其和MM的关系,以健康体检者血清（NC组）和MGUS血清（MGUS组）作对照。我们使用荧光定量PCR检测循环miR-21的表达,采用特种蛋白仪分析血清β2-MG及lambda和kappa轻链,免疫球蛋白IgG、IgA、IgM,用常规生化分析乳酸脱氢酶（LDH）、血清白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）及Ca2+,并用血液分析仪检测血红蛋白（Hb）,然后分析这些临床参数与循环miR-21的相关性。结果,我们发现MM患者组血清循环miR-21的表达水平为1.98±0.32,显著高于MGUS组0.76±0.20（p=0.014）和NC组0.43±0.11 （p=0.001）,MGUS组与NC组的表达水平无统计学差异（p=0.119）。分析表明循环miR-21与国际分期系统（ISS）分期有相关性,根据ISS分期,MM组中I期患者的循环miR-21表达量为0.86+0.19,显著低于II期2.77+0.64和III期2.86+0.53（P<0.05）。II期和III期间未显示有统计学差异。进一步的相关性分析显示,MM患者血清循环miR-21水平与血kappa轻链（r=0.532, p=0.013）及血kappa与lambda轻链的浓度和（r=0.615, p=0.003）呈显著正相关,与血清IgG（r=0.542,p=0.011）及血清IgG、IgA、IgM的浓度和（r=0.625, p=0.002）显著正相关,与β2-MG呈显著正相关（r=0.491, p=0.024）,与血清ALB呈负相关（r=-0.585, p=0.002）。而与GLB （r=-0.357, p=0.112）、LDH （r=0.250, p=0.280）、Hb （r=-0.286, p=0.209）及Ca2+ （r=-0.227, p=0.225）无显著相关性。这些数据说明,循环miR-21与MM瘤细胞负荷及预后相关。第二部分miR-21促进MM细胞生存与耐药的机制上述的研究表明,MM患者循环miR-21表达升高,相关性分析说明miR-21的水平与MM患者的瘤细胞负荷及预后有关,这表明miR-21参与了MM的进展,那miR-21是如何参与MM?有研究显示MAPK/ERK信号通路的抑制因子SPRY2是miR-21调控靶点之一。据此我们推测,MM中高表达的miR-21可能通过SPRY2调控MAPK/ERK信号,进而介导骨髓瘤细胞的生长及耐药。那抑制骨髓瘤细胞miR-21表达是否能抑制骨髓瘤细胞生长或增强骨髓瘤细胞对药物的敏感性?在本部分我们采用Western blot和荧光定量PCR检测MM患者骨髓细胞miR-21及其靶点SPRY2的表达;在体外转染miR-21的抑制物下调miR-21表达,观察对骨髓瘤细胞凋亡、耐药和迁移的影响;另外使用慢病毒载体LV-anti-mir21表达抑制体抑制骨髓瘤细胞miR-21,观察对裸鼠体内成瘤的影响,以阐明miR-21在MM瘤细胞生长及耐药中的作用机制。结果,MM骨髓单个核细胞样本中miR-21表达较高而SPRY2蛋白表达较低或沉默。骨髓瘤细胞中miR-21对SPRY2蛋白有调控作用,过表达SPRY2影响MAPK/ERK信号通路的活性且抑制IL-6诱导的骨髓瘤细胞生长。miR-21对骨髓瘤细胞具有促进生长和抗凋亡作用,骨髓瘤细胞U266转染miR-21模拟物（micmics）显著增强对药物Dex和Dox诱导的凋亡耐受,转染抑制体（inhibitor）可显著增强对药物Dex和Dox的敏感性,同时能抑制骨髓瘤细胞的迁移。通过慢病毒介导表达miR-21抑制体,可抑制骨髓瘤细胞U266在BALB/c小鼠皮下成瘤。这些数据说明miR-21在MM细胞中抑制SPRY2的表达,使MAPK/ERK信号的过度活化,促进骨髓瘤细胞的生长和耐药。第三部分NF-κB对MM细胞miR-21基因转录的调控骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞（BMSCs）粘附可触发NF-κB等多个生存信号通路。上述的研究及有关文献表明miR-21在MM及其它肿瘤中高表达,那是什么内在机制促使miR-21在MM及其它恶性疾病中高表达?已有研究发现转录因子AP-1,PU.1及STAT3可调控miR-21转录,而我们的研究发现骨髓瘤细胞miR-21表达可被NF-κB特异性抑制剂BAY 11-7082所抑制,因此我们推测NF-κB对miR-21可能有调控作用。在本部分,我们将骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞共培养刺激,观察miR-21的表达变化,然后用生物软件TFSEARCH分析miR-21基因转录启始点上游的序列,根据分析结果,将潜在的NF-κB结合位点序列合成生物素标记的探针,然后与U266细胞的核蛋白提取物进行EMSA试验。结果,我们的数据表明,骨髓瘤细胞经BMSCs共培养刺激后,miR-21表达上调且可被NF-κB特异性抑制剂BAY 11-7082所抑制,预测的NF-κB结合位点序列与U266核蛋白有显著结合,这种结合可被NF-κB特异性抑制剂所抑制。这些结果表明miR-21基因启动子区存在NF-κB的结合位点,并且说明NF-κB能影响miR-21的转录。综上所述,我们的研究表明miR-21在骨髓瘤细胞和MM患者血清中高表达,MM骨髓单个核细胞中SPRY2低表达或不表达,miR-21可抑制SPRY2使MAPK/ERK信号过度活化,从而导致骨髓瘤细胞生长和耐药。此外,骨髓瘤细胞中miR-21基因启动子区存在转录因子NF-κB的结合位点,NF-κB可影响miR-21基因转录。因此,miR-21有望作为MM治疗的一个潜在靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 循环miR-21在MM患者血清的表达及意义
• 1. 引言
• 2. 材料
• 3. 方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 第二部分 miR-21 调控MM 细胞生长及耐药机制
• 1. 引言
• 2. 材料
• 3. 方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 第三部分 NF-κB对MM细胞miR-21基因转录的调控
• 1. 引言
• 2. 材料
• 3. 方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述一 miR-21 在肿瘤中的研究进展
• 参考文献
• 综述二 循环miRNA在肿瘤诊断中的研究进展
• 参考文献
• 在读期间论文发表情况
• 参加会议及获奖情况
• 致谢