CSD基因在大鼠胰岛细胞中的表达及牛磺酸对大鼠糖尿病治疗作用研究

论文摘要

目的:研究牛磺酸合成限速酶CSD基因在大鼠胰岛细胞中的表达及糖尿病情况下表达量变化,并在此基础上观测治疗性添加牛磺酸（Tau）对于链脲佐菌素（STZ）所致糖尿病大鼠糖脂代谢、抗氧化能力、胰岛细胞凋亡以及胰岛内分泌细胞等方面的影响,探讨牛磺酸治疗糖尿病的作用机制,为应用牛磺酸治疗糖尿病提供理论依据。方法:1.将250-300g雄性Wistar大鼠麻醉后,胆总管原位灌注胶原酶V,38℃水浴消化胰腺组织,Histopaque 1077密度梯度离心纯化胰岛细胞,DTZ检测纯度,葡萄糖刺激检测胰岛细胞活性。2.提取分离纯化后的大鼠胰岛细胞总RNA,根据NCBI上的大鼠脑部CSD基因序列,设计一对特异性的引物,进行RT-PCR扩增。将扩增产物回收后,与PMD18-T克隆载体连接,并转化到Ecoli DH5α感受态细胞,通过对菌液PCR鉴定后测序,并将测序结果与大鼠脑部CSD核苷酸序列进行比对。3.向胰岛细胞的培养基中加入一定量STZ,并用半定量PCR的方法测定STZ组和对照组胰岛细胞CSD基因的相对表达量。4.从120只Wistar雄性大鼠中随机取15只作为正常对照组,其余105只大鼠按50mg/kg体重一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）。72h后用血糖仪测鼠尾静脉空腹血糖。血糖值≥16.7mmol/L,且出现明显的”三多”症状为标准,确认为糖尿病模型。5.造模成功后随机分成7组,正常对照组（Control组）、糖尿病模型组（DM模型组）、高剂量牛磺酸治疗组（4.3 g/kg bw Tau治疗组）、中剂量牛磺酸治疗组（3 g/kg bwTau治疗组）、低剂量牛磺酸治疗组（1.7 g/kg bw Tau治疗组）、罗格列酮治疗组（4mg/kgbw RSG治疗组）、胰岛素治疗组（20 iu Ins治疗组）。连续治疗70d,期间动态观测空腹血糖。治疗第8周时杀鼠,测定血清中C-肽（C-P）、胰高血糖素（Glu）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）的含量。6.取大鼠胰腺组织做石蜡切片,分别用HE染色观察胰岛组织形态,TUNEL原位末端标记法检测胰岛细胞的凋亡百分率,用免疫组化法染色观察胰岛细胞中Fas、Bax、Bcl-2的蛋白表达量。结果:1.每只大鼠可获得约800个胰岛细胞,其纯度在95%以上,所得胰岛细胞具有良好的活性。2.成功扩增出长为2044bp的基因片段,其编码区在18-1433bp,共编码470个氨基酸,相对分子质量为53KDa。测序结果显示该基因片段与参考的大鼠脑部CSD基因序列同源性达到99%。3.STZ处理后胰岛细胞中CSD基因表达量明显下降,其水平显著低于对照组。4.105只正常大鼠经STZ腹腔注射72h后,90只造模成功。在随后2个月实验过程中,DM模型组大鼠体重持续下降,Tau组体重明显高于DM模型组,RSG组和Ins组与DM模型组相比差异不显著。5.Tau组和Ins组血糖明显降低,而DM模型组血糖一直维持在高水平,RSG组血糖有一定程度降低,但作用不明显。经统计学检验,Tau组与DM模型组比较,血糖均有显著降低（P＜0.05）。6.Tau组C-肽水平显著升高,胰高血糖素显著降低。同时Tau能不同程度的降低血清TG,TC,MDA含量;升高SOD,GSH-Px,T-AOC,HDL值。7.（1）HE光镜下观察DM模型组胰岛萎缩,胰岛数量减少,大部分胰岛细胞完全融合,出现玻璃样变性,核溶解。Tau组与其他治疗组相比胰岛结构尚完整,细胞变性程度较轻。（2）胰岛素免疫组化观察,糖尿病模型组中β细胞表达胰岛素显著减少,牛磺酸治疗组β细胞表达胰岛素量明显高于模型组,并表现一定的剂量依赖性,罗格列酮组和胰岛素组与低剂量牛磺酸组接近。（3）TUNEL标记及计数,DM模型组残存的胰岛内有大量胰岛细胞凋亡,Tau高剂量治疗组仅发现少量凋亡细胞,凋亡率明显低于其他治疗组,低剂量组胰岛内亦可见大量凋亡胰岛细胞,中剂量治疗组较少,罗格列酮组和胰岛素组与DM模型组相比差异不显著。（4）凋亡相关因子的免疫组化结果表明:Control组Bcl-2高表达,Bax、Fas低表达;DM模型和Ins组较正常对照组Bcl-2表达降低,而Bax、Fas表达明显增高（P＜0.05）。Tau组明显抑制STZ所致的Bcl-2表达降低和Bax、Fas表达增高（P＜0.05）。RSG组也抑制了Bcl-2表达降低和Bax、Fas表达增高,但是不如Tau组明显。结论:1.大鼠胰岛细胞中存在CSD基因的表达。2.STZ处理的大鼠胰岛细胞CSD基因的相对表达量下降。3.给糖尿病模型大鼠治疗性灌胃牛磺酸能够调控胰岛内分泌,改善与糖尿病相关的血液生化指标,并通过调节凋亡相关基因Fas和Bcl家族成员间的平衡,发挥抗凋亡作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1.糖尿病的病因及发病机制
• 1.1 Ⅰ型糖尿病
• 1.2 Ⅱ型糖尿病
• 1.3 特殊糖尿病
• 1.4 妊娠糖尿病（GDM）
• 2.糖尿病与胰岛内分泌
• 2.1 胰岛素与糖尿病
• 2.2 胰高血糖素与糖尿病
• 3 糖尿病的治疗药物
• 4.牛磺酸的概述
• 4.1 牛磺酸的理化性质
• 4.2 牛磺酸的分布
• 4.3 牛磺酸的代谢
• 4.4 牛磺酸在体内的合成
• 4.5 牛磺酸的生物学功能
• 5.牛磺酸与糖尿病
• 5.1 牛磺酸与Ⅰ型糖尿病
• 5.2 牛磺酸与Ⅱ型糖尿病
• 5.3 牛磺酸与妊娠糖尿病
• 5.4 牛磺酸与糖尿病并发症
• 5.4.1 糖尿病眼部病变
• 5.4.2 糖尿病肾病
• 5.4.3 糖尿病性神经症状
• 5.4.4 糖尿病性动脉粥样化
• 实验一 大鼠胰岛细胞的分离纯化
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2.结果与分析
• 2.1 原位灌注
• 2.2 分离纯化后的胰岛细胞
• 2.3 胰岛细胞活性鉴定结果
• 3.讨论
• 3.1 供体体重的选择
• 3.2 胶原酶V的配置及浓度选择
• 3.3 正确的原位灌注
• 3.4 消化时间和温度的控制
• 3.5 胰岛细胞纯化
• 4.小结
• 实验二 半胱亚磺酸脱羧酶（CSD）基因在胰岛细胞中的表达
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2.结果与分析
• 2.1 CSD基因的PCR扩增结果
• 2.2 克隆产物的PCR鉴定结果
• 2.3 测序序列核苷酸及氨基酸同源性比较
• 2.4 PCR反应条件的优化
• 2.5 半定量PCR的检测结果
• 3.讨论
• 3.1 基因的选择
• 3.2 CSD基因的克隆及同源性分析
• 3.3 半定量PCR结果分析
• 4.小结
• 实验三 STZ诱导大鼠糖尿病模型的建立及牛磺酸对大鼠血糖的影响
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 成模状况
• 2.2 一般状况观察
• 2.3 血糖检测结果
• 3.讨论
• 3.1 糖尿病动物模型的建立和评定
• 3.2 牛磺酸对糖代谢的影响
• 4.小结
• 实验四 牛磺酸对与糖尿病发病相关的血液生化指标的影响
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 测定指标及检测方法
• 1.3 数据分析方法
• 2.结果与分析
• 2.1 不同组大鼠血清中C-肽和胰高血糖素比较
• 2.2 血清SOD、GSH-Px、MDA、T-AOC值的比较
• 2.3 不同组大鼠血清TC、TG和HDL值比较
• 3.讨论
• 3.1 牛磺酸对大鼠血清中C-肽的影响
• 3.2 牛磺酸对大鼠血清Glu的影响
• 3.3 牛磺酸对糖尿病大鼠抗氧化能力的影响
• 3.4 牛磺酸对糖尿病大鼠血脂的影响
• 4.小结
• 实验五 牛磺酸对糖尿病大鼠胰岛细胞形态及抗凋亡的影响
• 1.材料
• 1.1 实验动物及分组
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要药品、试剂
• 2.方法
• 2.1 胰腺切片的制备
• 2.2 石蜡切片HE染色
• 2.3 胰岛细胞胰岛素测定
• 2.4 胰腺组织凋亡检测
• 2.5 胰腺组织Fas,Bax,Bcl-2的测定
• 2.6 数据统计分析
• 3.结果与分析
• 3.1 HE染色观察胰岛的组织形态学改变
• 3.2 免疫组织化学观察胰岛β细胞形态、胰岛素表达
• 3.3 TUNEL法检测各组胰腺细胞凋亡情况比较
• 3.4 胰腺组织Fas,Bax,Bcl-2蛋白表达比较
• 4.讨论
• 4.1 STZ对胰岛的影响
• 4.2 牛磺酸对胰岛细胞的保护作用
• 5.小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 英文缩写
• 致谢
• 攻读学位期间文章发表情况