论文摘要
目的近年来胃癌的发病率有所降低,但仍是世界上第四大恶性肿瘤,并且死亡率高居第二。尽管对胃癌患者的诊断和治疗有了长足的进步,但进展期胃癌的预后效果依然很差。2000年大约880 000人被诊断患有胃癌,同时将近650 000人死于胃癌。在过去的几年中,已经证实胃癌的发生发展是多基因改变的结果。胃癌中特殊基因的表达异常在不同的细胞功能中发挥重要作用,例如细胞粘附、信号传导、细胞分化、细胞增殖、细胞转移、DNA修复和糖基化改变。更好的了解胃癌发生发展的分子机制将有利于胃癌诊断、治疗和预防的提高。但是胃癌的基因改变的具体机制尚不完全清楚。P21活化激酶1（p21-activated kinase 1,Pak1）,作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是小G蛋白Rho家族Cdc42和Rac1的主要下游靶蛋白,被活化后具有激酶活性,参与其信号通路,在细胞骨架重组、细胞迁移、细胞凋亡及基因转录调节等方面起重要作用。Pak1除了能被小GTPase活化外,还能被其它蛋白活化参与其信号通路。Janus激酶2（Janus kinase 2,JAK2）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3-kinase,PI3K）可以通过磷酸化的方式使Pak1活化,而蛋白激酶A（proteinkinase A,PKA）可以通过磷酸化使Pak1失活。Pak1还可以通过几个磷酸化位点发生自我磷酸化,其中包括位于自我抑制环的Thr423。以前的研究结果表明Rac1与胃癌的TNM分期正相关,下调的RhoA表达能够抑制胃癌细胞的生长。但是关于Pak1和胃癌的关系研究很少。方法一、Pak1影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。1、western blot和免疫组化检测Pak1在胃癌组织中的表达情况。2、Pak1激酶分析检测BGC823、MGC803、SGC7901、MKN1、MKN45细胞中Pak1的活性情况,同时检测这些细胞的运动和侵袭能力。3、将化学合成的Pak1siRNA转染BGC823细胞后,进行western blot检测、MTT增殖分析、运动和侵袭能力分析。4、构建Pak1稳定下调细胞系后,绘制生长曲线、非锚定依赖生长分析,并且检测运动和侵袭能力。5、将野生型BGC823细胞、对照稳定细胞系、Pak1下调细胞系（17号克隆）通过皮下、腹腔和尾静脉分别注射到三组裸鼠体内。通过动物实验检测Pak1在体内的增殖和转移能力。二、Pak1影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移的机制。1、Pak1在BGC823细胞中调节Cyclin B1的表达。（1）免疫组化检测对照稳定细胞系、17号克隆在裸鼠皮下形成的移植瘤。（2）Western blot检测Pak1稳定下调细胞系中Cyclin B1的表达。（3）将Pak1激活型质粒转染BGC823细胞后western blot检测Cyclin B1蛋白的表达。（4）Northern blot检测Pak1稳定下调细胞系中Cyclin B1 mRNA的表达。2、Pak1在BGC823细胞中调节Cyclin B1启动子的活性。（1）瞬时转染Cyclin B1荧光素酶报道质粒到Pak1稳定下调细胞系中,检测Cyclin B1启动子的活性。（2）瞬时转染GST-PID到BGC823细胞中,检测Cyclin B1启动子的活性。（3）瞬时转染野生型Pak1和激活型Pak1质粒到BGC823细胞中,检测CyclinB1启动子的活性。3、AO/EB双重染色法检测Pak1是否促进胃癌BGC823细胞诱导腹膜间皮细胞凋亡。4、定量PCR检测miRNA-100在照稳定细胞系、17号克隆中的表达情况。5、转染miRNA-100的成熟体和抑制子后,检测BGC823细胞的增殖、运动和侵袭能力。结果一、Pak1影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。1、Pak1的蛋白表达在Ⅳ期胃癌组织中明显升高,淋巴结转移灶中的表达高于原发灶。2、Pak1活性高的细胞有更强的运动能力和侵袭能力。3、瞬时下调Pak1的表达,抑制BGC823胃癌细胞的增殖、运动、侵袭能力。4、稳定下调Pak1的表达,抑制BGC823胃癌细胞的增殖、运动、侵袭能力。5、稳定干涉Pak1的胃癌细胞在裸鼠体内成瘤性降低,转移能力减弱。二、Pak1影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移的机制。1、Pak1在胃癌BGC823细胞中调节Cyclin B1的表达。2、Pak1在胃癌BGC823细胞中调节Cyclin B1启动子的活性。3、Pak1促进胃癌BGC823细胞诱导腹膜间皮细胞凋亡。4、Pak1在胃癌BGC823细胞中调节miRNA-100的表达。5、miRNA-100影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。结论1、Pak1能够在体内和体外影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。2、Pak1在胃癌BGC823细胞中调节Cyclin B1的表达。3、Pak1促进胃癌BGC823细胞诱导腹膜间皮细胞凋亡。4、Pak1在胃癌BGC823细胞中调节miRNA-100的表达。5、miRNA-100影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。
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