玉米醇溶蛋白水解酶菌株筛选及制备抗高血压肽研究

论文摘要

本论文以玉米醇溶蛋白为原料，采用微生物发酵产酶来水解玉米醇溶蛋白制备抗高血压肽，大大提高玉米蛋白粉的附加值和对玉米资源的综合利用率，同时为新型降血压制剂或功能性食品的研制提供依据。实验从Aspergillus oryzae（3042、IF-39、3800、J-rapid）、Bacillus natto、Mucor hiemallis等菌株中分别筛选出产碱性蛋白酶酶活高的菌株为：Bacillus natto；产中性蛋白酶酶活高的菌株为：Aspergillus oryzae IF-39。并通过实验确定了Bacillus natto菌的最佳培养条件为：培养基为麦麸豆粕比2︰3，培养基初始pH9.0，初始水分含量80%，培养温度37.5℃，培养时间72h，接菌量1.5mL（1.025×107个菌落/mL）；Aspergillus oryzae IF-39菌的最佳培养条件为：培养基为麦麸豆粕比3︰2，培养基初始pH8.0，初始水分含量60%，培养温度为28℃，培养时间为96h，接菌量3环（6.9×106个菌落/环）。以玉米醇溶蛋白为底物进行酶解，确定了Bacillus natto菌产酶水解玉米醇溶蛋白的最佳酶解条件为：底物浓度10%，加酶量8000U/g，温度40℃，pH9.5，水解时间180min，在此条件下得到的水解度达到33.8%；Aspergillus oryzae IF-39菌产酶水解玉米醇溶蛋白的最佳酶解条件为：底物浓度10%,加酶量7500U/g，温度35℃，pH7.0，水解时间120min，在此条件下得到的水解度达到33.5%。通过试验比较，确定以Sephadex G-25作为水解玉米醇溶蛋白水解产物分离纯化的介质，并且确定了Bacillus natto菌产酶水解玉米醇溶蛋白水解产物分离纯化条件为：上样量1.5mL，洗脱速度1.0mL/min，洗脱液为pH9.0硼酸缓冲液。Aspergillus oryzae IF-39菌产酶水解玉米醇溶蛋白水解产物分离纯化的条件为：上样量1.5mL，洗脱速度1.5mL/min，洗脱液为pH7.5磷酸缓冲液。在上述条件下进行分离纯化水解物，分别得到了五个分离组分。并且确定Bacillusnatto菌产酶水解玉米醇溶蛋白水解产物分离纯化所得的五个组分中，组分3、4、5的ACE抑制活性较高，其中组分3的抑制活性最高，可以达到89.4%。 Aspergillus oryzaeIF-39菌产酶水解玉米醇溶蛋白水解产物分离纯化所得的五个组分中，组分3、4、5的ACE抑制活性较高，其中组分4的抑制活性最高，可以达到85.2%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 玉米醇溶蛋白的概况及应用研究
• 1.2.1 关于玉米醇溶蛋白的概况
• 1.2.2 玉米醇溶蛋白的组成
• 1.2.3 玉米醇溶蛋白的理化性质
• 1.2.4 关于玉米醇溶蛋白的应用研究
• 1.3 酶解玉米蛋白的研究发展状况
• 1.3.1 微生物蛋白酶的生产工艺及技术
• 1.3.2 酶解玉米蛋白的研究及现状
• 1.4 降血压肽的研究进展
• 1.4.1 ACE 抑制肽的作用原理
• 1.4.1.1 ACE 对血压的调节作用
• 1.4.1.2 ACE 抑制肽的作用机制
• 1.4.2 ACE 抑制肽的构效关系
• 1.4.3 ACE 抑制肽活性的评价
• 1.5 本课题立题意义和主要研究内容
• 第二章 菌株筛选及菌株培养条件的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 原材料
• 2.2.2 菌种与培养基
• 2.2.3 药品与试剂
• 2.2.4 仪器设备
• 2.3 方法
• 2.3.1 酶活的测定
• 2.3.1.1 试剂的制备
• 2.3.1.2 L-酪氨酸标准曲线的绘制
• 2.3.1.3 酶活测定
• 2.3.1.4 酶活力的计算
• 2.3.1.5 酶活力单位的定义
• 2.3.2 酶样的制备
• 2.3.3 蛋白酶酶活高菌株的筛选
• 2.3.4 菌株培养条件优化
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 酪氨酸标准曲线
• 2.4.2 菌株筛选
• 2.4.3 菌株培养条件的优化
• 2.4.3.1 单因素实验
• 2.4.3.2 正交试验
• 2.5 小结
• 第三章 酶解玉米醇溶蛋白条件的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 原料
• 3.2.3 药品与试剂
• 3.2.4 仪器与设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 缓冲液的制备
• 3.3.2 酶液的提取与浓缩
• 3.3.3 水解过程
• 3.3.4 酶的热稳定性的测定
• 3.3.5 蛋白质水解度的测定
• 3.3.6 酶解玉米醇溶蛋白水解条件的研究
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 酶的热稳定性
• 3.4.2 茚三酮标准曲线
• 3.4.3 玉米醇溶蛋白水解条件单因素实验
• 3.4.3.1 最适底物浓度的确定
• 3.4.3.2 最适 pH 的确定
• 3.4.3.3 最适加酶量的确定
• 3.4.3.4 最适水解时间的确定
• 3.4.4 Bacillus natto 菌产酶水解玉米醇溶蛋白正交试验
• 3.4.5 Aspergillus oryzae IF-39 菌产酶水解玉米醇溶蛋白正交试验
• 3.5 小结
• 第四章 水解产物的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 原材料
• 4.2.2 仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 水解产物的分离纯化
• 4.3.1.1 凝胶的溶涨
• 4.3.1.2 装柱
• 4.3.1.3 上样洗脱
• 4.3.1.4 收集与测定
• 4.3.2 分离介质的选择
• 4.3.3 洗脱速度的选择
• 4.3.4 上样量的选择
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 Sephadex G-25、Sephadex G-75 装柱检测
• 4.4.2 Bacillus natto 菌产酶水解产物分离纯化条件的确定
• 4.4.2.1 分离介质的确定
• 4.4.2.2 洗脱速度的确定
• 4.4.2.3 上样量的确定
• 4.4.3 Aspergillus oryzae IF-39 菌产酶水解产物分离纯化条件的确定
• 4.4.3.1 分离介质的确定
• 4.4.3.2 洗脱速度的确定
• 4.4.3.3 上样量的确定
• 4.5 水解产物的分离纯化
• 4.6 小结
• 第五章 ACE 抑制活性的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 实验材料与主要试剂
• 5.2.2 实验主要仪器
• 5.3 方法
• 5.3.1 试剂的配置方法
• 5.3.2 检测波长的选择
• 5.3.3 ACE 抑制率测定方法
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 检测波长的选择
• 5.4.2 ACE 抑制活性的测定
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢