论文摘要
目的：建构基于类RA（类风湿性关节炎）模型的雷公藤致药源性大鼠卵巢功能耗损模型体系平台；初步探索补肾法与减味寿胎丸对模型大鼠卵巢功能的保护和修复作用,为研究药源性卵巢功能耗损模型系列以及拓展减味寿胎丸临床研究奠定基础。方法：1.雷公藤致LRAM雌性SD大鼠药源性卵巢功能耗损模型建构与评价研究目的：探索雷公藤致基于类RA模型的雌性SD大鼠药源性卵巢功能耗损建模方法,评价模型可靠性和稳定性。1.1大鼠LRAM的构建分组及造模方法：11-12月龄SPF级雌性SD大鼠40只,随机分为A、B、C、D四组,其中D为空白对照组,A、B、C三组为类RA炎症模型（LRAM）组,每组10只。每次取弗氏完全佐剂0.2mL,注射于模型组每只大鼠左侧足垫,前后足各0.1mL,对照组大鼠注射0.1mL生理盐水,测量大鼠足容积和大鼠质量,大鼠阴道脱落细胞检查,观察大鼠一般情况,连续观察21天。主要观察指标：大鼠一般情况,大鼠足容积,大鼠动情周期。1.2雷公藤致LRAM雌性SD大鼠药源性卵巢功能耗损模型分组及造模方法：6月龄SPF级雌性SD大鼠40只,随机分为A、B、C、D四组,每组10只,其中,A、B、C三组进行LRAM造模,然后,A、B两组再进行GTT不同剂量造模,C作为模型对照组,不参与GTT造模,D为空白对照组。A组：先造LRAM:每次取弗氏完全佐剂0.2mL,注射于组内每只大鼠左侧足垫,前后足各0.1mL,测量大鼠足容积,连续观察21天。再造GTT75mg模型：以75mg/kg/dGTT灌胃；B组：先造LRAM:（同A组相应部分）,再造GTT50mg模型：以50mg/kg/d GTT灌胃,A、B组灌胃量均为1mL/100g,每日定时检测实验大鼠质量、阴道脱落细胞和进行行为学观察,连续30天。C组：先造LRAM:（同A组相应部分）,然后,作为模型对照组,以3mL/d生理盐水灌胃,每日定时检测实验大鼠质量、阴道脱落细胞和进行行为学观察,连续30天。D组：作为空白对照组,以3mL/d生理盐水灌胃,每日定时检测实验大鼠质量、阴道脱落细胞和进行行为学观察,连续30天。主要观察指标：大鼠一般情况（包括行为学）,大鼠动情周期,大鼠卵巢形态及超微结构（卵巢指数,子宫指数,各级卵泡计数）,血清FSH、LH、E2、INHB及AMH均值水平,以及大鼠卵巢功能相关基因及蛋白表达水平。2雷公藤致健康雌性SD大鼠药源性卵巢功能耗损模型建构与评价研究目的：作为实验1的平行对照模型,为实验1提供对照参数。分组及造模方法：6月龄SPF级健康雌性SD大鼠30只,随机分为A、B、C三组,每组10只,其中,A、B为GTT不同剂量造模组,C为空白对照组。A组：以75mg/kg/dGTT灌胃；B组：以50mg/kg/d GTT灌胃,A、B组灌胃量均为1mL/100g,每日定时检测实验大鼠质量、阴道脱落细胞和进行行为学观察,连续30天。C组：作为空白对照组,以3mL生理盐水灌胃,连续30天。主要观察指标：大鼠一般情况（包括行为学）,大鼠动情周期,大鼠卵巢形态及超微结构（卵巢指数,子宫指数,各级卵泡计数）,血清FSH、LH、E2、INHB及AMH均值水平,与大鼠卵巢功能相关基因及蛋白表达水平。3基于天癸时限性的雷公藤致大鼠药源性卵巢功能耗损模型建构方法研究研究目的：探索雌性SD大鼠药源性卵巢功能耗损与年龄时间轴的相关性,探讨内经天癸时限性理论对研究卵巢功能耗损性疾病的临床意义。分组及造模方法：3、6、11～12月龄SPF级雌性SD大鼠各40只,各年龄段大鼠分别随机分为A、B、C、D四组,每组10只,其中,A、B两组进行LRAM造模,然后,A组再进行GTT75mg剂量造模,B组作为模型对照组,D作为空白对照组,不参与GTT造模,C直接进行GTT75mg剂量造模。A组：先造LRAM:每次取弗氏完全佐剂0.2mL,注射于组内每只大鼠左侧足垫,前后足各0.1mL,测量大鼠足容积,连续观察21天。再造GTT75mg模型：以75mg/kg/dGTT灌胃；B组：先造LRAM:（同A组）,然后,作为模型对照组,以3mL/d生理盐水灌胃；C组：直接造GTT75mg模型：以75mg/kg/dGTT灌胃,A、C组灌胃量均为1mL/100g;D组：作为两种GTT模型的共用空白对照组,以3mL/d生理盐水灌胃,各组每日定时检测实验大鼠质量、阴道脱落细胞和进行行为学观察,连续30天。主要观察指标：大鼠一般情况（包括行为学）,大鼠动情周期,大鼠卵巢形态及超微结构（卵巢指数,子宫指数,各级卵泡计数）,血清FSH、LH、E2、INHB及AMH均值水平,以及大鼠卵巢功能相关基因及蛋白表达水平。4减味寿胎丸拮抗雷公藤对健康雌性SD大鼠卵巢功能影响的研究研究目的：探索减味寿胎丸对雷公藤生殖毒性的拮抗作用,为临床预防性用药提供实验依据。分组及造模方法：6月龄SPF级雌性SD大鼠50只随机分为A、B、C、D、E五组,每组10只,其中,A、B、C三组分别用减味寿胎丸高剂量、低剂量和戊酸雌二醇片常规剂量灌胃,再同步进行GTT75mg造模,D组直接进行GTT75mg剂量造模,E为空白对照组,不参与造模。A组、B组及C组每日上午9时定时检测实验大鼠质量,然后分别以75mg/kg/dGTT灌胃,灌胃量均为1mL/100g,并进行阴道脱落细胞检查和行为学观察,下午3时分别灌服高剂量减味寿胎丸溶液、低剂量减味寿胎丸溶液及戊酸雌二醇片溶液,连续30天。D组：每日上午9时定时检测实验大鼠质量,然后以75mg/kg/dGTT灌胃,灌胃量为1mL/100g,并进行阴道脱落细胞检查和行为学观察,连续30天。E组：每日上午9时定时检测实验大鼠质量,灌服3mL生理盐水,并进行阴道脱落细胞检查和行为学观察,连续30天。主要观察指标：大鼠一般情况（包括行为学）,大鼠动情周期,大鼠卵巢形态及超微结构（卵巢指数,子宫指数,各级卵泡计数）,血清FSH、E2、INHB及AMH均值水平,与大鼠卵巢功能相关基因及蛋白表达水平。5减味寿胎丸干预对雷公藤致基于LRAM模型及健康雌性大鼠药源性卵巢功能耗损的卵巢保护作用实验目的：探索雷公藤致基于LRAM及健康雌性SD大鼠药源性卵巢功能耗损后减味寿胎丸对卵巢功能的修复作用。分组及造模方法：6月龄SPF级雌性SD大鼠100只随机分为A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E和F组,共10组,每组10只,其中,A1、A2设为基于健康、基于LRAM雌性SD大鼠减味寿胎丸高剂量组,B1、B2设为基于健康、基于LRAM雌性SD大鼠减味寿胎丸低剂量组,C1、C2组设为基于健康、基于LRAM雌性SD大鼠戊酸雌二醇片常规剂量组,D1、D2设为基于健康、基于LRAM雌性SD大鼠模型组, E设为LRAM模型对照组,F设为共用空白对照组。A1、B1、C1及D1组每日上午9时定时检测实验大鼠质量,然后以75mg/kg/dGTT灌胃,灌胃量均为1mL/100g,并进行阴道脱落细胞检查和行为学观察,连续30天,分别改以灌服高剂量减味寿胎丸溶液、低剂量减味寿胎丸溶液、戊酸雌二醇片溶液及3m1生理盐水,连续30天。A2、B2、C2及D2组均先造LRAM:每次取弗氏完全佐剂0.2mL,注射于组内每只大鼠左侧足垫,前后足各0.1mL,测量大鼠足容积,连续观察21天。然后,每日上午9时定时检测实验大鼠质量,以75mg/kg/dGTT灌胃,灌胃量均为1mL/100g,并进行阴道脱落细胞检查和行为学观察,连续30天,再分别改以灌服高剂量减味寿胎丸溶液、低剂量减味寿胎丸溶液、戊酸雌二醇片溶液及3m1生理盐水,连续30天。E组：先造LRAM:（同A2）,然后,每日上午9时定时检测实验大鼠质量,灌服3mL生理盐水,并进行阴道脱落细胞检查和行为学观察,连续60天。F组：与雷公藤造模同步,每日上午9时定时检测实验大鼠质量,灌服3mL生理盐水,并进行阴道脱落细胞检查和行为学观察,连续60天。主要观察指标：大鼠一般情况（包括行为学）,大鼠动情周期,大鼠卵巢形态及超微结构（卵巢指数,子宫指数,各级卵泡计数）,血清FSH、LH、E2、INHB及AMH均值水平,与大鼠卵巢功能相关基因及蛋白表达水平。结果：1.雷公藤致大鼠药源性卵巢功能耗损模型及卵巢功能评价体系平台建构（实验1～实验3）类RA炎症模型（Like rheumatoid arthritis model, LRAM）建构：三个模型组大鼠关节均先后出现关节红、肿胀,关节活动障碍等急慢性炎症反应,均对大鼠动情周期无显著影响,模型具有稳定性和可重复性。雷公藤致大鼠药源性卵巢功能耗损模型建构方法研究：两个雷公藤剂量模型组均能造成LRAM及健康雌性SD大鼠卵巢结构和功能实质损伤,模型组大鼠卵巢储备功能下降,模型大鼠子宫损伤程度较轻,两种雷公藤致大鼠药源性卵巢功能耗损模型建模方法所造模型均具有稳定性和可重复性。基于天癸时限性的雷公藤致大鼠药源性大鼠卵巢功能耗损模型建模方法研究：依据内经天癸时限性理论,用同一剂量雷公藤多甙片（GTT）对不同年龄段LRAM及健康雌性SD大鼠进行干预,通过观察大鼠卵巢功能结局,比较不同年龄段大鼠对同一外界干预因素的反应性及结局差异。两种造模方法均能造成不同年龄段模型大鼠卵巢结构和功能实质损伤,但损伤程度有明显差异,3月龄组损伤最轻,6月龄组和12月龄组损伤较严重。两种造模方法所造模型大鼠同一年龄段比较,卵巢结构损伤基本一致,但在卵巢功能损伤程度、与卵巢功能相关的血清实验室指标及相关基因和蛋白表达等方面存在差异,卵巢功能损伤程度与造模方法和年龄时间轴存在某种相关性。2补肾法及减味寿胎丸对雷公藤致药源性卵巢功能耗损模型大鼠卵巢功能的影响研究（实验4-5）减味寿胎丸拮抗雷公藤对健康雌性SD大鼠卵巢功能影响的研究：依据中医未病先防,已病防变的治未病思想以及补肾法在妇女生殖健康调节方面的重要作用,我们选用补肾方一减味寿胎丸早期拮抗干预雷公藤生殖毒性。减味寿胎丸早期拮抗干预雷公藤生殖毒性,能基本保持健康雌性SD大鼠卵巢结构完整,保持或恢复部分模型大鼠动情周期,显著上调模型大鼠原始卵泡计数均值水平,显著下调模型大鼠血清FSH及FSH/LH比值均值水平,显著下调GDF-9mRNA相对表达量均值水平,减味寿胎丸用药剂量和用药时机与最终结局存在某种相关性。减味寿胎丸干预对雷公藤致基于LRAM模型及健康雌性大鼠药源性卵巢功能耗损的卵巢保护作用：依据补肾法在妇女生殖健康和生殖障碍性疾病防治方面的重要作用,我们选用补肾方一减味寿胎丸晚期修复干预雷公藤生殖毒性对药源性卵巢功能耗损模型大鼠造成的卵巢结构及功能的损伤。减味寿胎丸晚期修复干预雷公藤生殖毒性有一定效果,减味寿胎丸晚期干预能修复模型大鼠部分卵巢结构和生殖功能,减味寿胎丸累积用量的起效点与所用模型本身受雷公藤生殖毒性影响程度有密切关系,减味寿胎丸晚期修复干预对两种造模方法所造雷公藤致药源性卵巢功能耗损模型大鼠卵巢功能修复效果存在差异。结论：1.本研究首次在类RA炎症模型（LRAM）的基础上建立雷公藤卵巢功能耗损之SD大鼠模型。此复合模型可以反映治疗药物的生殖毒性作用,较好地模拟临床现象,是一种方便易行且稳定的造模方法。并证实这种基于基础疾病的药源性卵巢损伤模型与基于健康雌性大鼠的雷公藤POF模型存在差异。雷公藤生殖毒性主要作用靶器官为卵巢,对子宫无显著性影响；2.基于天癸时限性理论,建立三个年龄段的雷公藤致大鼠药源性卵巢功能耗损模型。将传统中医理论思维融入实验研究,模拟不同年龄段人群的药源性卵巢功能耗损发病特征,为进一步研究不同年龄段人群卵巢功能障碍性疾病的发病机制及干预方案提供理想的研究平台。3.构建基于LRAM模型的雷公藤药源性卵巢功能耗损模型以及基于天癸时限性的雷公藤卵巢功能耗损模型,并建立大鼠模型卵巢功能评价系统,形成较完整的研究平台,为今后进一步研究药源性卵巢功能耗损性疾病提供技术规范；4.补肾法能有效保护大鼠卵巢功能免遭或减轻药物生殖毒性破坏,减味寿胎丸是一个有效的补肾良方,能用于大鼠模型卵巢功能维持、防御和修复外源性药物生殖毒性对卵巢功能的破坏。