几丁寡糖结构类似物β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的化学合成及其诱导植物抗病性的研究

论文摘要

本论文以氨基葡萄糖为起始原料，采用化学合成的方法，设计合成了一系列不同聚合度的几丁寡糖结构类似物β-1，3-乙酰氨基葡聚糖，并测定了几丁寡糖及其结构类似物对植物抗病性的诱导作用，对几丁寡糖及其结构类似物诱导处理后烟草植株体内抗性相关酶系活性动态进行了检测和分析，试图探讨上述寡糖类诱导物分子结构与其诱导抗病性的关系。主要的研究结果如下：1．几丁寡糖结构类似物β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的化学合成β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖的合成：以氨基葡萄糖为化学合成的起始原料，用邻苯二甲酰基保护化合物7和8的2位氨基；以苄叉来保护其4，6位的羟基，避免了糖化反应发生在4位上，从而保证了糖苷键的连接具有特定的立体和区域选择性（β-1，3连接糖苷键）；化合物8还用硫烃基保护异头碳上羟基，使硫糖苷作为糖基供体，成为合成乙酰氨基葡聚糖的离去基团；化合物8的3位再用乙酰基加以保护，避免它同时作为糖基供体和糖基受体，只能充当糖基供体；由3位是自由羟基、异头碳上为甲氧基的化合物7作为糖基受体，以NIS-TfOH作催化剂，7和8发生糖基化反应，高区域、高立体选择性、高产率地合成了β-1，3连接的二聚糖9，其核磁共振氢谱也证实了新产生的糖苷键为β构型（J=8.40 Hz）。β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖和四糖的合成：将二聚糖9及随后得到的三聚糖15脱去3′或3″位的乙酰基，得到的化合物14和20，它们再作为糖基受体，与糖基供体8在NIS-TfOH催化下进行糖基化反应，即可得到β-1，3连接的乙酰氨基葡聚三糖15和乙酰氨基葡聚四糖21。核磁共振氢谱显示新产生的糖苷键为β构型（J=8.48Hz和J=8.40Hz）。β-1，3-乙酰氨基葡聚五糖的合成：化合物8先转化为异头碳为游离羟基的化合物25，然后又与三氯乙腈加成形成端基活化中间体三氯乙酰亚胺酯26。糖基供体26与3位为自由羟基，硫烃基保护异头碳的糖基受体5发生缩合反应，形成双糖27；27又作为糖基供体与糖基受体20反应生成五聚糖28。其核磁共振氢谱显示新产生的糖苷键为β构型（J=8.54 Hz和J=8.37 Hz）。β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的脱保护：分别尝试了醋酸水解、催化氢化以及对甲苯磺酸（PTSA）水解的方法来脱去苄叉保护基，醋酸会使得乙酰氨基葡聚糖分解，催化氢化适用于二糖9、三糖15以及四糖21的脱保护，但五糖28在催化氢化时反应不完全，只能使用对甲苯磺酸的水解。邻苯二甲酰氨基的脱保护，均采用水合肼在水溶性的乙醇中回流，得到游离的氨基中间体；之后，或者直接全乙酰化，将全乙酰化的产物分离纯化后再脱去乙酰基即得到纯度较高的二糖和三糖的终产物13和19；或者游离的氨基中间体直接选择性乙酰化，得到终产物24和31，再分离纯化。β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的结构确定：化学合成的4个β-（1→3）-2-脱氧-2-乙酰氨基葡聚糖，聚合度分别是从2—5，其准确的化学结构均通过高分辨质谱以及核磁共振1H NMR、13C NMR的分析确证。上述4个化合物的总收率分别为10.56％、3.08％、1.28％和0.33％。与天然的几丁寡糖不同，合成的4个乙酰氨基葡聚糖均采取了β-1→3糖苷键的连接方式，是几丁寡糖的结构类似物，其结构清楚、组分单一，从而提供了研究几丁寡糖诱导植物抗病活性与寡糖区域异构体之间关系的理想材料。化学合成的四个几丁寡糖结构类似物的化学结构Chemical structure of the four synthesized chitin oligosaccharide analogues2．β-1，3-乙酰氨基葡聚糖诱导黄瓜对枯萎病的抗性研究对5种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用：在实验室条件下，分别测定了3个供试寡糖即β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖和Lewisa三糖对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）等5种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用。结果显示，3个供试寡糖对上述病原菌的菌丝生长没有显著的抑制作用。黄瓜幼苗子叶期诱导对枯萎病的抗性：供试的3个寡糖，以5个不同浓度和2种诱导方法（叶面喷雾法和灌根法）对黄瓜幼苗分别进行诱导时，只有10μg／ml的β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖和β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖的叶面喷雾处理表现抗病性。而Lewisa三糖的所有诱导处理均不表现抗性。黄瓜胚根期诱导对枯萎病的抗性：在黄瓜胚根期，β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖和β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖浸泡处理种子胚根后，表现出抗病性，最低有效诱导浓度为5μg／ml。而Lewisa三糖的5个诱导浓度处理均不表现诱导抗病性。3个供试寡糖在黄瓜胚根期与幼苗子叶期对枯萎病的诱导抗性结果相似。3．β-1，4-乙酰氨基葡聚糖及β-1，3-乙酰氨基葡聚糖诱导烟草抗病性的研究活体接种条件下寡糖诱导烟草对黑胫病的抗性：7个供试寡糖，以1μg／ml、10μg／ml和100μg／ml 3种不同浓度诱导烟草植株，再活体茎杆接种烟草黑胫病菌后，Lewisa三糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚二糖处理均不表现抗病性；β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖的处理对黑胫病具有诱导抗性。在3种不同的诱导浓度中，10μg／ml是大多数供试寡糖适合的处理浓度。离体接种条件下寡糖诱导烟草对黒胫病的抗性：7个供试寡糖以10μg／ml的浓度对烟草植株进行诱导，再离体接种黑胫病菌后，β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖、Lewisa三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚二糖均无诱导抗性效果；只有β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖表现出诱导抗性。离体接种条件下寡糖诱导烟草对赤星病的抗性：7个供试寡糖以10μg／ml的浓度对烟草植株进行诱导，再离体接种赤星病菌后，β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖、Lewisa三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚二糖均无诱导抗性效果；β-1，3-乙酰氨基葡聚三糖、β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖、β-1，4-乙酰氨基葡聚三糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖这4个供试寡糖处理则表现诱导抗性。4．寡糖类诱导物的分子结构与其诱导抗病性之间的关系甲苷化Lewisa三糖的主链链接方式和糖残基类型对诱导效果的影响：甲苷化Lewisa三糖对于黄瓜枯萎病、烟草黑胫病和赤星病，均不具有诱导抗病效果，可能是因为其主链的链接方式和糖残基的类型与几丁寡糖及其结构类似物不同，因而影响了其诱导活性。通过与相关资料的比较，可知Lewis寡糖类型的主链链接方式可能是决定诱导活性的主要因素，但不能排除糖残基的类型对诱导活性的影响。C-1位的取代基团对诱导效果的影响：供试的7个寡糖均在还原端C-1含有取代的甲氧基，其诱导抗病效果却表现出极大差异，这说明了C-1位置上的甲氧基并非是决定这7个寡糖是否具有诱导活性的关键因素。几丁寡糖及其结构类似物的聚合度对诱导效果的影响：几丁寡糖及其结构类似物诱导植物抗病性需要达到最低聚合度的阀值，因寡糖类型及植物病害系统不同而有差异。几丁寡糖结构类似物分别诱导黄瓜枯萎病，烟草赤星病和烟草黑胫病的抗性有效聚合度最低为2，3和4；几丁寡糖诱导对烟草黑胫病和烟草赤星病抗性的有效聚合度最低为3。几丁寡糖及其结构类似物的糖苷键链接方式对诱导效果的影响：诱导抗性的产生，也许并不局限于乙酰氨基葡萄糖糖残基是否连接于C-4的位置，碳骨架主链是否采取β-1，4链接方式。β-1，4的糖苷键链接方式并非唯一的、可形成具有诱导活性的乙酰氨基葡聚糖的链接方式，碳骨架主链采取β-1，3链接方式而形成的几丁寡糖结构类似物——β-1，3-乙酰氨基葡聚糖同样具有诱导植物的抗病活性。几丁寡糖及其结构类似物诱导抗病性的特点：几丁寡糖及其结构类似物的诱导抗病性属于系统的诱导抗病性，具有广谱性（非特异性）诱导抗性的特点。5．β-1，3-乙酰氨基葡聚糖及β-1，4-乙酰氨基葡聚糖诱导烟草抗病性的生理机制寡糖的诱导对3种防御酶活性变化的影响：5个供试寡糖诱导酶活性的不同效果具体表现在总体酶活水平、酶活峰值及到达最高峰的时间。β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖显著提高了POD、PPO和PAL的酶活性，诱导后48h达到酶活峰值，上述2寡糖对3种酶活性诱导效果分别为40％和99％；238％和186％；81％和73％，均高于相应的其他三种寡糖的诱导处理。寡糖诱导的酶活性变化与烟草黑胫病诱导抗性效果之间的关联性：β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖可诱导烟草对黑胫病的抗病性；同时也可诱导过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）这3种酶活性的显著性增加。表明β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖诱导的POD、PPO和PAL这3种酶的活性提高与诱导烟草对黑胫病抗病性之间在是相对应的，具有关联性。寡糖的分子结构对3种防御酶活性的影响：在5个供试寡糖中，聚合度均为4的β-1，3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚四糖均可诱导POD、PPO和PAL这3种酶的酶活显著增加；而具有同样的化学结构，聚合度仅仅为2的β-1，3-乙酰氨基葡聚二糖和β-1，4-乙酰氨基葡聚二糖的总体酶活性与对照相接近。这表明了聚合度大小是影响几丁寡糖及其结构类似物对POD、PPO和PAL这3种酶活性诱导效果的因素之一。β-1，3和β-1，4糖苷键分别链接形成的几丁寡糖结构类似物和几丁寡糖，均可诱导烟草的抗病性和POD、PPO和PAL 3种抗性酶的活性，说明了几丁寡糖及其结构类似物的化学结构具有影响POD、PPO和PAL这3种酶活性变化的化学分子结构特征。

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中文摘要

Abstract

第一章文献综述

第一节寡糖的结构、生物学功能和化学合成

1 化学生物学的内涵和研究内容

1.1 化学生物学的内涵

1.2 化学生物学的研究方向

1.3 化学生物学的研究内容

2 糖生物学和化学糖生物学

2.1 糖生物学的重要性及产生

2.2 糖生物学的内涵及其研究内容

2.3 糖类的结构与生物学功能

2.4 化学糖生物学的发展

3 寡糖的结构类型、生物学功能和化学合成

3.1 寡糖的结构类型

3.2 寡糖的生物学功能

3.3 寡糖的化学合成

第二节植物的诱导抗病性

1 植物诱导抗病性的产生及其概念

2 植物诱导抗病性的类型

3 激发子

3.1 生物型激发子（生物激发子,生物诱导物）

3.2 非生物型激发子（非生物激发子,非生物诱导物）

3.3 内源性激发子

3.4 外源性激发子

4 与植物诱导抗病性相关的的生理生化反应

4.1 细胞壁物质的沉积与氧化交联

4.2 富含脯氨酸糖蛋白的积累

4.3 木质素的积累

4.4 酚类物质的积累

4.5 氧化突发

4.6 抗病性相关酶活性的变化

4.7 植物保卫素的形成

4.8 病程相关蛋白的产生

4.9 过敏反应

4.10 次生代谢的加强

5 诱导抗病性的特点

5.1 不改变植物的遗传性

5.2 诱导物种类繁杂

5.3 广谱性（非特异性）

5.4 可控性

5.5 持续性

5.6 安全性、饱和性和传导性

6 诱导过程中的三个时间参数

第三节几丁寡糖和壳寡糖的结构、制备及其生物学功能

1 几丁寡糖及其类似物的基本结构

2 几丁寡糖和壳寡糖的制备

2.1 化学法

2.2 酶法（生物酶法）

2.3 物理法

3 几丁寡糖及其类似物的生物学功能

3.1 对生物的生理作用

3.2 抑菌作用

3.3 作为促进双歧杆菌生长的因子

3.4 在药物开发和医疗诊断方面的应用

3.5 结瘤因子

3.6 诱导作用

第四节几丁寡糖类激发子的诱导抗病性

1 寡糖类激发子的种类

1.1 葡聚寡糖

1.2 几丁寡糖和壳寡糖

1.3 半乳糖醛酸寡糖

1.4 木葡聚糖寡糖

2 几丁寡糖类激发子的植物诱导抗病性

2.1 几丁寡糖类激发子的植物诱导抗病作用

2.2 几丁寡糖类激发子诱导的生理生化反应

3 影响几丁寡糖类激发子诱导活性的因素

3.1 几丁寡糖类激发子的聚合度

3.2 几丁寡糖类激发子主链的连接方式和糖残基类型

3.3 几丁寡糖类激发子上的取代基团

3.4 几丁寡糖类激发子的诱导浓度

3.5 植物体系和植物组织

3.6 其他影响因素

4 几丁寡糖类激发子的结合位点与结合受体

4.1 外源凝集素

4.2 几丁质酶类似蛋白

4.3 小结

5 几丁寡糖类激发子的细胞识别机制

5.1 两步识别机制

5.2 几丁质分解代谢传感器激酶的模型

第五节课题的选题依据,研究目的及意义

1.选题依据

1.1 植物诱导抗病性

1.2 几丁寡糖和壳寡糖的激发子作用

1.3 化学合成几丁寡糖及其类似物的必要性

2 研究的目的和意义

3 研究的技术路线

第二章几丁寡糖结构类似物β-1,3-乙酰氨基葡聚糖的化学合成

引言

第一节 β-1,3-乙酰氨基葡聚糖化学合成的路线设计

第二节 β-1,3乙酰氨基葡聚糖化学合成的策略分析

1 氨基葡萄糖合成单元制备的策略分析

1.1 氨基葡萄糖合成单元Ⅰ的制备

1.2 氨基葡萄糖合成单元Ⅱ的制备

1.3 氨基葡萄糖合成单元Ⅲ的制备

2 β-1,3乙酰氨基葡聚糖合成的策略分析

2.1 β-1,3乙酰氨基葡聚二糖的合成

2.2 β-1,3乙酰氨基葡聚三糖的合成

2.3 β-1,3乙酰氨基葡聚四糖的合成

2.4 β-1,3乙酰氨基葡聚五糖的合成

第三节 β-1,3乙酰氨基葡聚糖的化学合成过程

1 实验条件

1.1 所用的仪器

1.2 所用试剂和药品

1.3 特殊试剂和药品的准备

2 实验与结果

2.1 氨基葡萄糖合成单元Ⅰ的制备

2.2 氨基葡萄糖合成单元Ⅱ的制备

2.3 氨基葡萄糖合成单元Ⅲ的制备

2.4 β-1,3乙酰氨基葡聚二糖的合成

2.5 β-1,3乙酰氨基葡聚三糖的合成

2.6 β-1,3乙酰氨基葡聚四糖的合成

2.7 β-1,3乙酰氨基葡聚五糖的合成

3 讨论与分析

第三章几丁寡糖结构类似物β-1,3-乙酰氨基葡聚糖诱导黄瓜对枯萎病的抗性研究

引言

1.材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 3个寡糖诱导物对5种植物病原真菌菌丝生长的拮抗作用

2.2 3个寡糖在黄瓜胚根期诱导对枯萎病的抗性

2.3 3个寡糖在黄瓜幼苗子叶期诱导对枯萎病的抗性

3 讨论

3.1 3个供试寡糖对植物病原真菌的拮抗作用

3.2 β-1,3-乙酰氨基葡聚二糖和β-1,3-乙酰氨基葡聚三糖在幼苗子叶期的诱导抗病性

a三糖在幼苗子叶期的诱导抗病性'>3.3 Lewis^a三糖在幼苗子叶期的诱导抗病性

3.4 3个寡糖诱导物在黄瓜胚根期的诱导抗病性

3.5 黄瓜幼苗期叶面喷雾和灌根2种不同诱导方法的诱导抗病性

3.6 供试寡糖不同诱导浓度对诱导抗病性的影响

3.7 几丁寡糖的化学结构对诱导抗性的影响

第四章几丁寡糖β-1,4-乙酰氨基葡聚糖及其结构类似物β-1,3-乙酰氨基葡聚糖诱导烟草抗病性的研究

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果与分析

2.1 供试的7个寡糖活体条件下诱导烟草对黑胫病的抗性分析

2.2 供试的7个寡糖离体条件下诱导烟草对黑胫病的抗性分析

2.3 供试的7个寡糖离体条件下诱导烟草对赤星病的抗性分析

3 结论与讨论

3.1 寡糖的聚合度对植物诱导抗病性的影响

3.2 寡糖主链的糖苷键链接方式对植物诱导抗病性的影响

3.4 几丁寡糖及其结构类似物的取代基团甲氧基对诱导抗病性效果的影响

3.5 几丁寡糖及其结构类似物的诱导浓度对诱导抗病性效果的影响

3.6 不同的植物病害系统（黄瓜枯萎病,烟草黑胫病和烟草赤星病）对寡糖诱导抗病性的影响

3.7 烟草活体接种和离体接种对诱导抗病性效果的影响

3.8 几丁寡糖及其结构类似物诱导抗病性的特点

第五章几丁寡糖β-1,4-乙酰氨基葡聚糖及其结构类似物β-1,3-乙酰氨基葡聚糖诱导烟草抗病性的生理机制

引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 5个供试寡糖诱导烟草对过氧化物酶活性的影响

2.2 5个供试寡糖诱导烟草对多酚氧化酶酶活性的影响

2.3 5个供试寡糖诱导烟草对苯丙氨酸解氨酶活性的影响

3 结论与讨论

3.1 寡糖诱导对烟草几种防御酶活性变化的影响

3.2 β-1,3-乙酰氨基葡聚四糖和β-1,4-乙酰氨基葡聚四糖诱导3种防御酶活性的比较

3.3 5个供试寡糖诱导3种酶活性变化与烟草黑胫病诱导抗性的关系

3.4 5个供试寡糖的化学结构对几种防御酶活性的影响

参考文献

附录1:符号说明

附录2:攻读博士学位期间发表和录用的论文

几丁寡糖结构类似物β-1，3-乙酰氨基葡聚糖的化学合成及其诱导植物抗病性的研究

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