论文摘要
伴随着人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）的完成,诞生了一大批新基因。目前公认的人类编码蛋白质的基因数量大约在20,000-25,000个,其中大部分基因功能还不明确,这就为生物学各个领域的研究提供了巨大的未知空间。本实验室与国家人类基因组北方研究中心合作,采用反向生物学策略,对大批量的人类未知功能基因进行了克隆与功能研究。通过对NCBI的RefSeq数据库进行搜索,并汇集其他来源的人类预测基因,总计未知功能基因序列约6,900条。经序列校正与分析,挑出近3,000个Est支持较好基因,确定其ORF并设计引物PCR扩增,连入真核表达载体pcDNA3.1B中,共计得到1,000多个克隆,形成一个人类未知功能基因ORF文库。为了研究和筛选上述新基因与细胞凋亡、增殖、分化、转化、损伤修复等细胞重要生命活动的相关性,人类基因组北方中心,建立了多个细胞筛选平台,其中DCUN1D3就是利用其中的SRE细胞筛选平台、通过高通量筛选技术获得的。SRE（serum response element）存在于许多立即早期基因（immediate early gene, IEG）上游的启动子序列中,比如c-fos, fosB, junB, egr-1 and -2;与其相互作用的转录因子有SRF, ELK-1, SAP1, TFII and NET（TCF family）;血清,溶血磷脂酸（LPA）,LPS,佛波脂及紫外线等能够通过MAPK信号转导途径诱导活化SRE。而SRE所启动的立早基因与细胞增殖,细胞凋亡等细胞生命活动密切相关。为此,在前期工作中,我们利用整合内参荧光素酶PRL活性（Renilla Luciferase,海肾荧光素酶;Rinilla luciferase更多地被用作转染效率的内参,以消除细胞数量和转染效率的差异）[11]的实验体系,将目的基因表达质粒与上游包含血清反应元件（SRE）的萤火虫荧光素酶报告质粒共转,对能够启动立早基因上游调控元件SRE活性的基因进行了细胞高通量筛选,获得了一个能够活化SRE的新基因DCUN1D3。1、生物信息学及表达谱、细胞内定位分析（1）生物信息学分析:DCUN1D3基因是一个没有任何功能报道的新基因,其编码314个氨基酸,富含亮氨酸,包含一个未知功能结构域298 （DUF298）。生物信息学分析无跨膜区,无明显的信号肽,C末端含有一个四个碱性氨基酸组成的核定位信号。在MiniMotif数据库中对DCUN1D3进行可能的Motif搜索发现,在273位氨基酸附近有一个识别未配对胸腺嘧啶的Motif,而胸腺嘧啶二聚体的形成是紫外线损伤DNA的特异指标。在214位和250位氨基酸位点各有一个可能的ATM激酶磷酸化位点,ATM是有活性的共济失调毛细血管扩张突变激酶（ataxia telangiectasia mutated）的英文简称,作为监测DNA双链断裂的关键分子参与了一系列DNA损伤反应。同时2006年cell杂志的一篇文献提示在该基因第一个内含子上有一个潜在的p53结合位点。以上种种线索提示DCUN1D3与DNA损伤可能有联系。（2）DCUN1D3基因的表达谱分析及细胞内定位首先利用RT-PCR方法证实DCUN1D3基因在多种肿瘤细胞系中都有转录。进一步,我们又制备了DCUN1D3基因的原核表达蛋白,并利用其制备了DCUN1D3特异性抗体。免疫组化及Western blot结果证实了DCUN1D3蛋白的天然存在。而且,RT-PCR、免疫组化及Western blot结果表明,DCUN1D基因在多种正常组织和肿瘤组织以及多种肿瘤细胞系中广谱表达。更有意义的是,实时定量PCR及免疫组化的结果显示, DCUN1D3的表达水平在正常组织中往往高于其配对的肿瘤组织。细胞内定位研究结果显示, DCUN1D3在细胞质及细胞核均匀分布,以胞质和核周分布为主。2、进一步证实了DCUN1D3活化血清反应元件（SRE）其次,我们进一步验证了DCUN1D3对SRE的活化作用,并进一步探讨其活化SRE的可能机理。初步实验结果提示,DCUN1D3可能不是通过ELK1和SRF调节SRE活性的,并且DCUN1D3对于血清刺激的MAPK信号途径中ERK的通路活化没有协同作用。提示DCUN1D3是通过其它机制活化SRE。3、DCUN1D3与DNA损伤的关系生物信息学分析结果提示DCUN1D3可能与DNA损伤有联系。（1）首先,我们探讨了DCUN1D3在紫外线照射（UVC）和离子照射（ionizing irradiation）条件下的表达水平变化,结果表明紫外线照射和离子照射均可使DCUN1D3的mRNA和蛋白水平明显上调。（2）有文献提示在DCUN1D3基因第一个内含子上有一个潜在的p53结合位点,因此我们探讨了DCUN1D3的表达上调是否依赖p53?我们的实验结果发现,超表达p53蛋白并不能增强DCUN1D3的表达;此外,在DNA损伤条件下,比较表达野生型p53的细胞系与p53缺陷型细胞系中DCUN1D3表达水平的差异,其实验结果不能得出其p53依赖性表达的结论。（3）由于生物信息学分析结果提示,其C端存在一个核定位信号,因此我们又探讨了DCUN1D3蛋白在DNA损伤因素作用下,在细胞内是否出现核转位变化?免疫细胞化学结果显示,在UVC损伤条件下,可以明显观察到内源性DCUN1D3向细胞核转位;利用外源性GFP-DCUN1D3融合蛋白也能够观察到类似的结果。进一步,我们又构建了缺失C端20个氨基酸的GFP-DCUN1D3融合蛋白。实验结果表明缺失了C端的GFP-DCUN1D3蛋白变得不稳定并且丢失了入核能力。提示DCUN1D3蛋白的核转位是依赖其C端的核定位信号。（4）探讨了DCUN1D3蛋白在DNA损伤因素作用下对细胞周期及生存的影响。我们合成并筛选出了特异性沉默DCUN1D3基因的siRNA。将其转染入细胞,观察在DNA损伤条件下,DCUN1D3基因被沉默后对细胞周期和细胞存活的影响。结果显示, DCUN1D3 siRNA有意义地增加了S期细胞比率;同时细胞凋亡数目明显减少。同时检测了DNA损伤信号通路中一些至关重要的分子,如p53,cyclin D1等等。发现这些分子也都有一定程度的减少。提示DCUN1D3基因在UVC引发的DNA损伤修复通路中扮演了一个重要的角色。4、寻找DCUN1D相互作用分子DCUN1D3是如何在细胞内发挥其生物学功能的?寻找其相互作用分子将成为解答这个问题的关键。首先通过生物信息学分析其可能的相互作用蛋白,同时检索文献发现小鼠的Dcun1d3可与泛素连接酶SCF复合体的各个成员以及CAND1分子相互作用,而小鼠Dcun1d3基因与人DCUN1D3有97%的同源性。因此,后期通过免疫共沉淀和DCUN1D3-GST-pulldown的方法,我们证实了DCUN1D3能够与SCF复合体中的cullin1分子、CAND1分子存在相互作用。提示其功能可能与泛素连接酶关系密切。未来的研究方向将基于这些分子间的相互作用,阐释它们在DNA损伤反应中的机制。综上所述,通过对新基因DCUN1D3的系统研究,第一次在国际上揭示了该基因与DNA损伤,尤其是紫外线损伤密切的关系。DNA损伤修复与基因组稳定性密切相关,因此我们的工作,为研究肿瘤癌变机制与开发具有临床应用价值的功能基因提供了重要的实验依据。